1. Préparation des réactifs
- Milieu de sels biliaires : Pour préparer un bouillon de soja tryptique contenant 0,4 % de sels biliaires (poids/volume), remettre en suspension 200 mg de sels biliaires dans 50 mL de BST autoclave. Le filtre stérilise à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Préparer des produits frais moyens chaque semaine.
Notes: Les sels biliaires couramment utilisés sont un mélange 1:1 de cholate de sodium et de désoxycholate de sodium isolé de vésicules biliaires d’ovins et de bovins. Comme démontré précédemment, la présence de glucose était nécessaire à la formation d’un biofilm induit par les sels biliaires. TSB a ajouté du glucose par rapport au bouillon Luria-Bertani (LB) ; et par conséquent, était suffisant pour induire la formation d’un biofilm chez Shigella et les autres agents pathogènes entériques analysés. Selon les bactéries à analyser, différentes concentrations de glucose ou différents besoins en sucre peuvent être nécessaires.
- 0,5 % p/v de violet cristallin dans l’eau : Dissoudre 2,5 g de violet cristallin dans 500 ml d’eau distillée. Stériliser par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
2. Préparation des bactéries
- Cultivez des cultures nocturnes des souches bactériennes à tester en inoculant 3 mL de BST avec une seule colonie bien isolée dans un tube de culture stérile. Incuber à 37 °C avec agitation à 225 tr/min pour une incubation d’une nuit (16 à 24 h).
note: Les souches doivent être retirées des stocks de congélation toutes les 2 à 4 semaines et maintenues sur des assiettes n’ayant pas plus de 2 semaines.
3. Essai d’adhérence en phase solide
REMARQUE : Ce test quantifie les bactéries adhérentes à l’aide d’une méthode sur plaque à 96 puits. Les bactéries se développent statiquement dans des plaques à fond plat. Le lavage est effectué pour éliminer les bactéries non adhérentes et les bactéries adhérentes sont colorées au violet cristallin. La coloration violette cristalline lie le peptidoglycane dans la paroi cellulaire bactérienne et peut être solubilisée à l’aide d’éthanol. Le nombre de bactéries adhérentes est déterminé en fonction de la rétention du violet cristallin.
- Installez deux tubes de 1,5 ml. Etiqueter avec TSB ou TSB + sels biliaires (BS).
- Ajoutez 1 mL de TSB ou TSB + BS dans les tubes respectifs.
- Inoculer les tubes avec 20 μL de culture pendant la nuit (à une dilution de 1:50).
- Dans une plaque stérile, transparente, à fond plat, traitée pour culture tissulaire à 96 puits, ajouter 130 μL/puits de milieu témoin non inoculé dans trois puits pour servir de témoin à blanc. Installez trois puits de contrôle pour chaque type de fluide (TSB et TSB + BS) à tester.
- Ajouter 130 μL/puits de culture inoculée dans trois puits et répéter l’opération jusqu’à ce que toutes les conditions expérimentales soient en trois exemplaires.
- Incuber pendant 4 à 24 h à 37 °C de manière statique.
- À l’aide d’un lecteur de plaques, enregistrez l’OD600. Réglez les puits de contrôle sur « vide ». Assurez-vous que le milieu de contrôle est clair et qu'il n'y a aucun signe de turbidité. Si une turbidité est détectée, jetez l’expérience. Les valeurs OD600 peuvent être utilisées pour normaliser les données s’il existe des différences significatives dans le taux de croissance entre les souches bactériennes.
- Retirez le milieu de culture à l’aide d’une conduite de vide en inclinant doucement la plaque et en aspirant lentement le milieu sur le bord inférieur du puits. Assurez-vous de collecter tout le milieu de culture sans perturber la population bactérienne adhérente située sur la surface en plastique. Si une matrice polysaccharidique extracellulaire (EPS) a été produite pendant la période d’incubation, la matrice sera visualisée comme un précipité blanc. Ne dérangez pas la matrice EPS.
- Lavez délicatement les puits une fois avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) de 200 μL. Retirez le lavage PBS à l’aide de la conduite d’aspiration.
- Retournez la plaque pour qu’elle sèche. Laisser sécher un minimum de 20 min.
note: Étant donné que le biofilm doit être soigneusement séché avant d’être coloré, le protocole peut être interrompu à cette étape pendant quelques heures, voire toute la nuit. Le temps de séchage supplémentaire n’altérera pas la procédure de coloration, tandis qu’un séchage incomplet affectera la quantification des résultats et la reproductibilité.
- Ajouter 150 μL de violet cristallin à 0,5 % à chaque expérience et bien contrôler.
- Incuber 5 min à température ambiante (RT).
- Lavez les puits une fois avec 400 μL d’eau distillée. Le volume supplémentaire aide à éliminer la tache violette cristalline résiduelle sur les côtés des puits. Retirez le lavage avec la ligne d’aspiration.
- Lavez les puits cinq fois avec 200 μL d’eau distillée. Retirez le lavage avec la conduite d’aspiration.
note: Un lavage minutieux est important pour la quantification. Lorsque les puits vides sont exempts d’eau distillée et ne contiennent aucune coloration violette cristalline résiduelle, passez à l’étape suivante.
- Retournez la plaque pour qu’elle sèche, à l’abri de la lumière. Assurez-vous du séchage complet de la plaque comme indiqué ci-dessus.
- Colorer les puits avec 200 μL d’éthanol à 95 %. Incuber la plaque sur le shaker pendant 30 min. Pour éviter l’évaporation, en particulier à des températures plus élevées, effectuez cette étape à 4 °C.
- À l’aide d’un lecteur de plaques, notez la densité optique à 540 (OD540).
note: La longueur d’onde pour l’absorbance maximale du violet cristallin est proche de 590 nm. La littérature fait état d’une gamme allant de OD540 à OD595 pour l’absorbance du violet cristallin ; Choisissez ainsi une longueur d’onde disponible en fonction du lecteur de plaques.