1. Préparation des réactifs
- Milieu de sels biliaires : Pour préparer un bouillon de soja tryptique contenant 0,4 % de sels biliaires (poids/volume), remettre en suspension 200 mg de sels biliaires dans 50 mL de BST autoclave. Stériliser par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Préparer des produits frais moyens hebdomadaires.
Notes: Les sels biliaires couramment utilisés sont un mélange 1:1 de cholate de sodium et de désoxycholate de sodium isolé de vésicules biliaires d’ovins et de bovins. Comme démontré précédemment, la présence de glucose était nécessaire à la formation d’un biofilm induit par les sels biliaires. TSB a ajouté du glucose par rapport au bouillon Luria-Bertani (LB) ; et par conséquent, était suffisant pour induire la formation d’un biofilm chez Shigella et les autres agents pathogènes entériques analysés. Selon les bactéries à analyser, différentes concentrations de glucose ou différents besoins en sucre peuvent être nécessaires.
- 0,5 % p/v de violet cristallin dans l’eau : Dissoudre 2,5 g de violet cristallin dans 500 ml d’eau distillée. Stériliser par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
- Concanavaline A (ConA) conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) : Reconstituer la matrice en 1x PBS. Diluer la substance concentrée de 10 mg avec 400 μL de 1x PBS jusqu’à une concentration finale de 25 μg/mL, et protéger de la lumière.
- PBS + Glucose : Dissoudre 0,2 g de glucose dans 10 mL 1x PBS (2 % p/v glucose final). Stériliser par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Préparer à la fraise le jour de l’utilisation.
- PBS + sels biliaires : Dissoudre 40 mg dans 10 mL 1x PBS (0,4 % p/v sels biliaires finaux). Stériliser par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Préparer à la fraise le jour de l’utilisation.
- PBS + glucose et sels biliaires : Dissoudre 40 mg de sels biliaires et 0,2 g de glucose dans 10 mL 1x PBS (0,4 % p/v sels biliaires et 2 % p/v de glucose final). Stériliser par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Préparer à la fraise le jour de l’utilisation.
- Préparez des plaques de gélose LB.
- Correctif de formaldéhyde/glutaraldéhyde : Ajouter 810 μL de formaldéhyde (solution mère à 37 %, concentration finale à 3 %) et 125 μL de glutaraldéhyde (solution mère à 25 %, concentration finale à 0,25 %) à 14 mL 1x PBS. Bien mélanger et conserver à 4 °C. Le correctif doit être froid pour une bonne utilisation.
prudence: La solution est toxique et nécessite l’élimination des déchets dangereux.
- Solution de montage anti-décoloration : Utilisez une solution de montage anti-décoloration contenant une coloration au 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour inhiber le photoblanchiment des échantillons de microscopie immunofluorescente tout en colorant par fluorescence l’ADN de la bactérie.
2. Préparation des bactéries
- Cultivez des cultures nocturnes des souches bactériennes à tester en inoculant 3 mL de BST avec une seule colonie bien isolée dans un tube de culture stérile. Incuber à 37 °C avec agitation à 225 tr/min pour une incubation d’une nuit (16 - 24 h).
note: Les souches doivent être retirées des stocks de congélation toutes les 2 à 4 semaines et maintenues sur des assiettes n’ayant pas plus de 2 semaines.
>3. EPS Détection matricielle
REMARQUE : Ces dosages complémentaires quantifient et visualisent l’EPS. Dans les deux cas, l’EPS est détecté à l’aide d’une lectine pour lier les polysaccharides. La protéine conjuguée par fluorescence permet la quantification.
- Détection semi-quantitative de l’EPS
- Installez deux tubes de 1,5 ml. Étiquette avec TSB ou TSB + BS.
- Ajoutez 1 mL de TSB ou TSB + BS dans les tubes respectifs.
- Inoculer les tubes avec 20 μL de culture pendant la nuit (dilution de 1:50).
- Dans une plaque stérile, noire, à fond plat, traitée à 96 puits et traitée pour culture tissulaire, ajouter 130 μL/puits de milieu témoin non inoculé dans trois puits pour servir de témoin à blanc. Installez trois puits de contrôle pour chaque type de fluide à tester. Ajouter 130 μL/puits de culture inoculée dans les puits et répéter l’opération jusqu’à ce que toutes les conditions expérimentales soient plaquées en trois exemplaires.
- Incuber pendant 4 à 24 h à 37 °C de manière statique.
- Transférez le milieu de culture dans une plaque transparente de 96 puits à l’aide d’une pipette, idéalement une pipette multicanaux. Veillez à ne pas collecter tout le milieu de culture sans perturber la population adhérente et/ou l’EPS situé sur la surface du plastique. Réserver.
- Fixez la plaque noire pendant 15 min à RT en utilisant 200 μL/puits de formaldéhyde/glutaraldéhyde dans 1x PBS.
- Pendant que la population adhérente se fixe, évaluez la fraction surnageante à partir de l’étape 1.1.6. À l’aide d’un lecteur de plaques, enregistrez l’OD600. Réglez les puits de contrôle sur « vide ». Assurez-vous que le milieu de contrôle est clair et qu'il n'y a aucun signe de turbidité. Si une turbidité est détectée, jetez l’expérience.
- Alternativement, l’ensemble du test peut être effectué dans une plaque inférieure noire transparente. Dans ce cas, les valeurs de DO600 peuvent être enregistrées et le milieu de culture peut être jeté par la suite avant de passer à l’étape 3.1.7. Les valeurs de DO600 peuvent être utilisées pour normaliser les données en cas de différences significatives dans le taux de croissance entre les souches bactériennes.
- Retirez le correctif et jetez-le dans les déchets dangereux.
- Lavez doucement les puits deux fois avec 200 μL/puits de PBS stérile. Retirez le lavage PBS à l’aide de la conduite d’aspiration en inclinant doucement la plaque et en aspirant lentement le lavage sur le bord inférieur du puits.
- Ajouter 150 μL/puits de 25 μg/mL de ConA-FITC et incuber pendant 15 min à RT.
- Laver délicatement deux fois avec 200 μL de PBS.
- Ajouter 150 μL de PBS dans chaque puits. Enregistrer la fluorescence à 488 nm.
