1. Préparation des réactifs
- Milieu de sels biliaires : Pour préparer un bouillon de soja tryptique contenant 0,4 % de sels biliaires (poids/volume), remettre en suspension 200 mg de sels biliaires dans 50 mL de BST autoclave. Stériliser par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Préparer des produits frais moyens hebdomadaires.
Notes: Les sels biliaires couramment utilisés sont un mélange 1:1 de cholate de sodium et de désoxycholate de sodium isolé de vésicules biliaires d’ovins et de bovins. Comme démontré précédemment, la présence de glucose était nécessaire à la formation d’un biofilm induit par les sels biliaires. TSB a ajouté du glucose par rapport au bouillon Luria-Bertani (LB) ; et par conséquent, était suffisant pour induire la formation d’un biofilm chez Shigella et les autres agents pathogènes entériques analysés. Selon les bactéries à analyser, différentes concentrations de glucose ou différents besoins en sucre peuvent être nécessaires.
- 0,5 % p/v de violet cristallin dans l’eau : Dissoudre 2,5 g de violet cristallin dans 500 ml d’eau distillée. Le filtre stérilise à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
- Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + glucose : Dissoudre 0,2 g de glucose dans 10 ml 1x PBS (2 % p/v de glucose final). Le filtre stérilise à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Préparer à la fraise le jour de l’utilisation.
- PBS + sels biliaires : Dissoudre 40 mg dans 10 mL 1x PBS (0,4 % p/v sels biliaires finaux). Stériliser par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Préparer à la fraise le jour de l’utilisation.
- PBS + glucose et sels biliaires : Dissoudre 40 mg de sels biliaires et 0,2 g de glucose dans 10 mL 1x PBS (0,4 % p/v sels biliaires et 2 % p/v de glucose final). Le filtre stérilise à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Préparer à la fraise le jour de l’utilisation.
- Préparez des plaques de gélose LB.
2. Préparation des bactéries
- Cultivez des cultures nocturnes des souches bactériennes à tester en inoculant 3 mL de BST avec une seule colonie bien isolée dans un tube de culture stérile. Incuber à 37 °C avec agitation à 225 tr/min pour une incubation d’une nuit (16 à 24 h).
note: Les souches doivent être retracées à partir des stocks de congélation toutes les 2 à 4 semaines et maintenues sur des assiettes n’ayant pas plus de 2 semaines.
3. Dosage de la dispersion
REMARQUE : Dans ce test, le désassemblage du biofilm par dispersion bactérienne est détecté. Ici, des biofilms matures sont établis et par la suite (généralement le lendemain), les milieux sont remplacés par du PBS ou du PBS supplémenté. Le composant surnageant est ensuite évalué pour quantifier le nombre de bactéries qui se sont dissociées du biofilm.
- Installez deux tubes de 1,5 ml. Etiqueter avec TSB ou TSB + BS (sels biliaires).
- Ajoutez 1 mL de TSB ou TSB + BS dans les tubes respectifs.
- Inoculer les tubes avec 20 μL de culture pendant la nuit (à une dilution de 1:50).
- Dans une plaque stérile, transparente, à fond plat, traitée pour culture tissulaire à 96 puits, ajouter 130 μL/puits de milieu témoin non inoculé dans trois puits pour servir de témoin à blanc. Configurez trois puits de contrôle pour chaque type de fluide à tester.
- Ajouter 130 μL/puits de culture inoculée dans trois puits et répéter l’opération jusqu’à ce que toutes les conditions expérimentales soient plaquées en trois exemplaires.
- Incuber la plaque pendant 4 à 24 h à 37 °C de manière statique.
- Avant de continuer, réchauffez le PBS, le PBS + glucose, le PBS + sels biliaires et le PBS + sels biliaires + glucose à 37 °C. Préparez ces réactifs frais tous les jours.
- À l’aide d’un lecteur de plaques, notez la densité optique, OD600. Réglez les puits de contrôle sur « vierge ». Assurez-vous que le fluide est clair et qu'il n'y a aucun signe de turbidité. Si une turbidité est détectée, jetez l’expérience. Les valeurs OD600 peuvent être utilisées pour normaliser les données s’il existe des différences significatives dans le taux de croissance entre les souches bactériennes.
- Retirez le milieu de culture à l’aide d’une ligne de vide. Assurez-vous de collecter tout le milieu de culture sans perturber la population adhérente située sur la surface du plastique.
- Lavez doucement les puits deux fois avec 200 μL/puits de PBS stérile. Retirez le lavage PBS à l’aide de la conduite d’aspiration.
- Remplacer le lavage par 130 μL/puits des éléments suivants dans trois puits chacun : PBS, PBS + glucose, PBS + sels biliaires et PBS + sels biliaires + glucose. Ces réactifs doivent être préchauffés à 37 °C.
- Incuber la plaque pendant 30 min à 37 °C.
- Retirez délicatement la plaque de l’incubateur à 37 °C. Transférez les surnageants dans une plaque fraîche et stérile à 96 puits.
- À l’aide d’une plaque à 96 puits ou d’un bloc de dilution, préparer des dilutions en série de 10 fois (1:10) du surnageant dans du PBS stérile.
note: La série de dilution doit aller de non diluée à 10-6 selon la souche bactérienne à tester. Des expériences pilotes peuvent être réalisées pour déterminer la plage de dilution optimale.
- Placer une plaque de 5 μL de chaque dilution sur une gélose LB à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber à 37 °C pendant la nuit. Comptez les colonies le lendemain et tenez compte du facteur de dilution pour déterminer les unités formant colonies (UFC) de récupération. Pour calculer le pourcentage de dispersion par rapport au témoin 1x PBS (fixé à 100 %), divisez l’UFC de récupération de chaque condition de traitement par l’UFC de récupération de l’échantillon de contrôle 1x PBS.
note: Des plaques de milieu de routine pour la souche bactérienne d’intérêt peuvent également être utilisées. Par exemple, Shigella peut être plaqué sur des assiettes rouge Congo. Assurez-vous que les plaques sont sèches pour des techniques de placage appropriées.
