$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Préparation d’un biofilm in vitro de bactéries sur la colonie fongique
- Centrifuger la culture bactérienne à 5 000 x g pendant 3 min et suspendre la pastille dans 25 ml de tampon stérile de phosphate de potassium 0,1 M (25 g/L KH2PO4 et 2,78 g/L K2HPO4, pH 5,8). Répétez cette étape une fois et ajustez la concentration bactérienne finale à 109 cellules/ml avec le même tampon.
- Remplissez une microplaque à 6 puits avec 5 ml de suspension bactérienne (ou un tampon stérile de phosphate de potassium de 0,1 M pour le témoin négatif).
- Coupez la membrane de cellophane de la culture fongique avec une lame de rasoir stérile pour obtenir des carrés de cellophane avec une seule colonie fongique sur chaque membrane. Retirez délicatement les carrés de cellophane contenant des hyphes du support solide à l’aide d’une pince et transférez le carré de cellophane contenant des hyphes dans un puits de la microplaque contenant la suspension bactérienne.
- Secouez doucement la microplaque pendant que les colonies fongiques sont encore attachées à la cellophane, puis retirez les feuilles de cellophane, en laissant les colonies fongiques dans la plaque.
- Incuber la microplaque en agitant doucement (~60 tr/min) à une température adaptée aux micro-organismes étudiés.
note: Le temps d’incubation dépend de la vitesse d’établissement du biofilm et de l’étape à analyser. Pour P. fluorescens BBc6/L. bicolor, incuber à 20 °C pendant 30 min pour obtenir des biofilms à un stade précoce et jusqu’à 16 h pour obtenir des biofilms matures.
2. Analyse par microscopie confocale à balayage laser de la formation du biofilm
- Préparation des échantillons
- Pour éliminer les bactéries planctoniques et les bactéries fixées électrostatiquement aux hyphes, rincez le champignon en le transférant dans une nouvelle microplaque à 6 puits remplie de 5 ml d’une solution saline forte (NaCl, 17 g/L) ; agitez doucement pendant 1 min.
- Transférez le champignon dans une nouvelle microplaque à 6 puits contenant 5 ml de tampon de phosphate de potassium stérile de 0,1 M, secouez doucement pendant 2 minutes et transférez le champignon dans un tampon de phosphate de potassium frais.
- Coupez la partie de la colonie fongique à imager avec un scalpel tout en la maintenant dans le tampon de phosphate de potassium, de sorte que la section obtenue contienne environ la moitié de la colonie fongique.
- Pour colorer l’échantillon, transférez-le dans une boîte de Pétri remplie d’eau stérile contenant un colorant fluorescent approprié (selon le but de l’analyse), et incubez-le dans l’obscurité.
- Pour visualiser le réseau fongique, utilisez par exemple Congo Red (0,1 % de concentration finale, 5 min d’incubation), la lectine d’agglutine de germe de blé (WGA) conjuguée à Alexa Fluor 633 (concentration finale de 10 μg/ml, 10 min d’incubation) ou FUN1 (concentration finale de 10 μM, 10 min d’incubation).
- Si vous utilisez une bactérie non fluorescente, contre-colorez les cellules bactériennes avec une sonde fluorescente spécifique de l’ADN parmi les nombreux colorants d’ADN perméables aux cellules disponibles dans le commerce. Par exemple, utilisez du DAPI (concentration finale de 0,25 μg/ml, 10 min d’incubation).
- Pour visualiser les protéines de la matrice, utilisez un colorant protéique.
- Après la coloration, rincez l’échantillon en le transférant dans un couvercle de boîte de Pétri contenant 10 ml de phosphate de potassium stérile de 0,1 M et agitez doucement pendant 1 min.
- Immergez à moitié une lame dans le couvercle de la boîte de Pétri et amenez délicatement la section coupée pour qu’elle flotte au-dessus de la diapositive. Ensuite, retirez lentement la lame de la solution tampon, en laissant l’échantillon se déposer doucement sur la lame.
note: Pour cette étape, il est très important de procéder en douceur pour éviter la perturbation du biofilm.
- Enfin, ajoutez 10 μl de fluide de montage anti-évanouissement à l’échantillon et couvrez-le d’une lamelle en verre.
note: Une fois la lame préparée, l’analyse microscopique doit être effectuée le plus rapidement possible (dans un délai maximum de 30 min) pour éviter toute modification de la structure du biofilm.