Analyse en temps réel de la migration des lymphocytes T résidents dans différentes régions tumorales à l’aide de la microscopie confocale

Résumé

Source : Peranzoni, Elisa, et al. Imagerie ex vivo des lymphocytes T CD8 résidents dans des coupes de tumeurs pulmonaires humaines à l’aide de la microscopie confocale. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo décrit l’imagerie de cellules T CD8 résidentes infiltrant la tumeur marquées avec des anticorps couplés par fluorescence dans des tranches de tumeurs pulmonaires humaines. Cette technique permet d’analyser en temps réel la migration des lymphocytes T CD8 à l’aide de la microscopie confocale.

Protocole

1. Immunomarquage des lymphocytes T CD8 résidents et des cellules tumorales

1. Diluer les anticorps (concentration finale 10 μg/mL) et le colorant nucléaire (concentration finale 1 μg/mL) dans un milieu RPMI-1640 sans rouge de phénol.
   note: Utilisez des anticorps anti-CD8 (IgG murins, clone SK1) et anti-EpCAM (molécule d’adhésion des cellules épithéliales) (IgG murins HEA-125) couplés par fluorescence pour marquer les lymphocytes T CD8 et les cellules épithéliales tumorales, respectivement. Utilisez un anticorps anti-CD90/Thy1 couplé par fluorescence (IgG murin, clone 5E10) pour marquer les fibroblastes et les cellules endothéliales activées. Utiliser le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour marquer le noyau des cellules dont la membrane plasmique est compromise afin d'évaluer la viabilité des tissus.
2. Retirez les plaques de culture de l’incubateur et utilisez une pipette pour aspirer tout liquide à l’intérieur des rondelles en acier inoxydable. Ne retirez pas le milieu RPMI-1640 de 1,1 ml placé sous les inserts de culture cellulaire.
3. Sans toucher la tranche et à l’aide d’une pointe de pipette, ajoutez 40 μL de la solution contenant les anticorps sur chaque tranche de tumeur.
4. Incuber la plaque à 37 °C pendant 15 min pour permettre la coloration des anticorps.
5. À l’aide d’une pince fine, retirez les rondelles, retirez les tranches et trempez-les 10 s dans un média RPMI-1640 sans rouge de phénol. Replacez les tranches sur les inserts de culture cellulaire et ajoutez une goutte de milieu RPMI-1640 sans rouge de phénol sur chaque tranche individuelle. Maintenir la plaque à 37 °C pendant 10 min. Passez à l’imagerie.

2. Imagerie et analyse de la migration des lymphocytes T CD8 résidents dans des coupes de tumeurs pulmonaires humaines

REMARQUE : Le microscope confocal utilisé dans ce protocole est un disque rotatif vertical équipé d’un objectif à immersion dans l’eau 25x (25x/0,95 N.A.).

1. Préparation de la configuration du microscope
   1. Réglez la température de la chambre chauffante du microscope à 37 °C quelques heures avant de commencer la séance d’imagerie.
   2. Mettre en place un système permettant de perfuser constamment les tranches tumorales avec un milieu RPMI oxygéné (5 % CO₂, 95 % O₂) sans rouge de phénol (Figure 1). À l’aide d’une pompe péristaltique, faire couler le milieu de perfusion dans la chambre d’imagerie et aspirer la solution dans une fiole de collecte des déchets.
   3. Faites fonctionner la pompe péristaltique pour permettre à la solution oxygénée de passer à travers les tubes de perfusion.
2. À l’aide d’une pince fine, retirez la tranche de la plaque à 6 puits et transférez-la dans le plat en plastique de 35 mm rempli de milieu RPMI sans rouge de phénol. Immobilisez la tranche à l’aide d’un ancrage de tranche de 19,7 mm de diamètre avec des filetages espacés de 2 mm. Placez la boîte de Pétri sur la platine d’imagerie du microscope. Connectez les embouts d’entrée et de sortie du système de perfusion. Allumez le système de perfusion et réglez le débit du média à 0,8 mL/min.
3. Abaissez l’objectif d’immersion dans l’eau sur la tranche. Concentrez-vous sur le haut de la tranche avec une lumière à champ vif. À l’aide d’une lumière fluorescente appropriée, sélectionnez une région d’intérêt qui contient des lymphocytes T CD8, des îlots tumoraux (positifs pour EpCAM) et une zone stromale (positive pour CD90). Vérifiez la viabilité des cellules à l’intérieur de la tranche en évaluant la coloration DAPI à la surface coupée et plus profondément dans le tissu.
   REMARQUE : Une tranche saine ne contient qu’une minorité de cellules DAPI-positives à plusieurs microns de la surface coupée.
4. Définissez une session d’imagerie avec les actions suivantes.
   1. En fonction de l’intensité du signal fluorescent des 3 fluorophores, réglez le temps d’exposition entre 50 et 800 ms et l’intensité laser entre 20 et 40
    %.
   2. Sélectionnez l’épaisseur de la pile z à imager dans la tranche de tumeur.
      note: Ici, 10 à 12 plans optiques couvrant une profondeur totale de 60 à 70 μm dans la dimension z ont été capturés.
   3. Sélectionnez la position de départ à environ 10 μm en dessous des premiers lymphocytes T CD8 marqués.
   4. Définissez l’intervalle de temps entre chaque image z-stack entre 10 et 30 s et la durée totale d’enregistrement entre 10 et 30 min.

Résultats

Figure 1 : Photographies du système de perfusion. A) La solution RPMI sans rouge de phénol est enrichie en 5 % de CO₂, 95 % O₂. B) La solution est ensuite perfusée par une pompe péristaltique. C) La solution RPMI pénètre dans la boîte de culture par l’entrée. À la sortie, la solution est aspirée par la pompe de la chambre dans un conteneur à déchets. Notez que l’embout d’...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope confocal droit	Leica	L’utilisation d’un disque confocal rotatif est recommandée
Logiciel Imaris	Plan binaire		Ce logiciel est utilisé pour la visualisation d’images et le suivi de la migration des lymphocytes T
Pinces fines	Instruments de précision mondiaux	Référence 14142
Inserts de culture de 30 mm	Millipore	PICM0RG50
Support du Roswell Park Memorial Institute (RPMI), supplément GlutaMAX	ThermoFisher	61870010	Le milieu RPMI complet est fabriqué en ajoutant 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur et de la pénicilline/streptomycine
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	ThermoFisher	20012019
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)	Invitrogen	14170088
Agarose à basse température de gélification, type VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Colle cyanoacrylate de butyle non toxique, Vetbond	3m	1469
Ancrages à tranches, diamètre 19,7, filetages espacés de 2 mm	Warner Instruments	Référence 64-1415
Rondelles en acier inoxydable, 5 mm de diamètre intérieur	amazone	B004K1FDGQ
Anti-CD8 conjugué au BV605 (clone SK1)	BD Biosciences	565289
Anti-EpCAM conjugué FITC (clone HEA-125)	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-098-113
Anti-CD90 conjugué BV510 (clone 5E10)	Biolégende	328125
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI	ThermoFisher	D1306