REMARQUE : Ce protocole met l’accent sur l’utilisation de la cytométrie en flux FRET pour détecter l’activité d’ensemencement à partir d’échantillons biologiques de souris. Il est également compatible avec les fibrilles recombinantes et les échantillons biologiques humains. L’euthanasie et le prélèvement cérébral chez la souris ont été effectués conformément aux procédures approuvées par l’IACUC.
1. Extraction du cerveau
- Après une anesthésie profonde avec de l’isoflurane (2 %), perfuser une souris avec du PBS glacé contenant 0,03 % d’héparine, et extraire le cerveau en suivant les détails décrits dans Gage et al.
- Placez le tissu extrait dans un flacon cryogénique et congelez-le en le plaçant dans de l’azote liquide. Vous pouvez également congeler des mouchoirs sur de la glace sèche. Une fois congelés, transférez les tissus à -80 °C et conservez-les pendant une période prolongée, si nécessaire.
note: Ce protocole est compatible avec les homogénats du cerveau entier ou les régions cérébrales micro-disséquées. Voir Hagihara et al.pour un protocole de micro-dissection détaillé.
2. Préparation du matériel semencier biologique
- Préparez le tampon d’homogénéisation en dissolvant les inhibiteurs de protéase (sans acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA]) dans 1x TBS (solution saline tamponnée au Tris, 1 comprimé pour 10 ml). Vortex vigoureusement et stocker sur de la glace. Les inhibiteurs de protéase doivent être exempts d’EDTA afin de préserver la viabilité des cellules du biocapteur.
- Pesez le tissu cérébral congelé dans un bateau de pesée jetable et transférez-le dans un tube conique de 5 ml. Ajouter un tampon d’homogénéisation glacé de sorte que la solution finale soit de 10 % en poids/volume. Stocker temporairement sur de la glace. La masse tissulaire et le volume du tampon d’homogénéisation subséquent varient en fonction de la taille du cerveau et/ou des régions utilisées. Ici, un hémicerveau de souris adulte pesant 0,2 g est suspendu dans 2 ml pour une solution à 10 % p/vol.
- Transférez les échantillons dans une chambre froide et ajustez un soniseur de sonde aux paramètres appropriés. Pour la sonication par sonde avec un Omni Ruptor (illustré ici), réglez la puissance sur 20 %, ce qui correspond à environ 75 W. Utilisez un mode d’impulsion pour vous assurer que les échantillons ne sont pas surchauffés pendant la sonication. Réglez l’émetteur sur 30 %, ce qui correspond à environ 500 ms.
- Nettoyez l’extrémité du sonificateur de sonde en rinçant à nouveau avec de l’eau, de l’isopropanol et de l’eau, en essuyant la sonde entre chaque solution. Assurez-vous de rincer et d’essuyer les côtés et le dessous de la sonde avec des lingettes de laboratoire.
- En travaillant avec un échantillon à la fois, plongez la pointe de la sonde dans le tampon d’homogénéisation et démarrez le sonicateur. En utilisant les paramètres de puissance et d’émetteur décrits ci-dessus, délivrez 25 impulsions au total. Assurez-vous que le tissu est complètement en suspension. Attention à ne pas faire mousser l’échantillon lors de cette étape.
note: Les échantillons sont susceptibles de mousser si a) le volume total est faible ou b) l’homogénat se réchauffe. Avec cet instrument spécifique, ne pas sonicer avec des volumes inférieurs à 250 μl. Pour s’assurer que les échantillons restent réfrigérés, les tubes peuvent être entreposés sur de la glace pendant cette étape.
- Nettoyez la sonde en essuyant le lysat résiduel, puis délivrez 10 impulsions dans un bécher d’eau propre. Rincez les côtés et le fond de la sonde avec de l’eau, de l’isopropanol et de l’eau à nouveau (comme à l’étape 2.4), en essuyant entre chaque étape. Pour éviter toute contamination, rincez soigneusement la sonde entre les échantillons.
note: Avec les agrégats tau, nous n’avons pas constaté que des méthodes de nettoyage plus strictes soient nécessaires pour prévenir la contamination d’un échantillon à l’autre. D’autres amyloïdes, cependant, peuvent nécessiter des soins supplémentaires qui ont été largement décrits dans la littérature.
- Stocker les homogénats sur de la glace jusqu’à ce que tous les échantillons aient été traités.
- Le spin s’homogéne à 21 300 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Transférez le surnageant dans un tube propre, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Jetez la pastille. Aliquote le surnageant et stocke les lysats à -80 °C pour une utilisation ultérieure. Évitez toutefois les cycles de gel/dégel des homogénats, car cela réduit l’efficacité de l’ensemencement.
3. Replacage des cellules de biocapteurs
REMARQUE : Utilisez quatre lignées cellulaires pour ce test : HEK 293T (lignée cellulaire #1), RD-P301S-CFP (lignée cellulaire #2), RD-P301S-YFP (lignée cellulaire #3) et RD-P301S-CFP/YFP (lignée cellulaire #4). Veuillez consulter le tableau de référence 1 pour la contribution de chaque lignée cellulaire à l'essai.
- Dans un environnement stérile, aspirer le milieu de culture. Rincez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) chaude et aspirez. Trypsiniser les cellules (3 ml de trypsine-EDTA (0,05 %)) pendant 3 min, tremper avec un milieu de culture chaud (9 ml de DMEM, 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de GlutaMax) et transférer immédiatement les cellules dans un tube conique.
- Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 5 min à RT. Aspirer le milieu et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture chaud.
- À l’aide d’un hémocytomètre, déterminez la densité cellulaire de chaque lignée cellulaire. La densité cellulaire varie en fonction de la confluence au moment de la récolte et du volume de remise en suspension. Remettre en suspension des cellules prélevées dans une boîte de 10 cm à 90 % de confluence dans un milieu de 10 ml, pour une densité cellulaire d’environ 1 million de cellules/ml.
- Faites un mélange maître de cellules + milieu de sorte que chaque puits d’une plaque de 96 puits contienne 35 000 cellules dans un milieu de 130 μl (par exemple, pour faire un mélange maître pour 100 puits, remettez en suspension 3,5 millions de cellules dans un milieu de 13 ml). Modifiez le numéro de cellule pour l’adapter aux plans d’expérience et aux calendriers individuels. Pour le traitement cellulaire ~18 heures après le placage, ajoutez 35 000 cellules à chaque puits d’une plaque de 96 puits.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, pipeter lentement 130 μl de suspension cellulaire Master Mix dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond plat, traitée pour culture tissulaire. Pendant le placage, placez l’extrémité de la pipette au centre du puits, sans toucher le fond de la plaque.
note: Bien que le format de placage puisse être modifié, il est recommandé de faire n = 4 puits pour chacune des lignées cellulaires de 1 à 3 par plaque. Le reste de la plaque (n = 84) est réservé à la lignée cellulaire #4 (cellules biocapteurs).
- Laissez les cellules se déstabiliser en laissant la plaque intacte pendant 10 min à RT. Incuber O/N à 37 °C, 5 % de CO2 et ≥80 % d’humidité relative.
4. Traitement des cellules
REMARQUE : Le lendemain, lorsque les cellules du biocapteur tau sont confluentes à 60-65 %, préparez les complexes de transduction des graines comme suit :
- Dans un seul tube, combinez un réactif de transfection, tel que la lipofectamine, avec un milieu sérique réduit, tel que Opti-MEM, pour obtenir un mélange maître. Par puits, ajoutez 1,25 μl de réactif de transfection et 8,75 μl de sérum réduit. Agitez doucement le tube pour mélanger, tournez brièvement et incubez pendant 5 min à RT.
- Dans un autre tube, combiner le matériel de semence (aliquote de lysat de l’étape 2.9) avec un milieu sérique réduit.
note: Le volume de matériel semencier variera en fonction de l’expérience individuelle. Lorsque vous choisissez le volume de graines, tenez compte de l’abondance de graines dans un échantillon et de la toxicité potentielle. Les homogénats bruts peuvent être toxiques pour les cellules. En tant que tel, utilisez le volume le plus bas possible pour surveiller l’effet souhaité. Les volumes de lysat/puits précédemment testés varient de 1 à 5 μl, ce qui correspond à 5 à 20 μg de protéines totales. Assurez-vous que le volume total par puits (graines + milieu sérique réduit) est de 10 μl.
- Combinez le contenu des deux tubes décrits aux sections 4.1 et 4.2, agitez doucement pour mélanger, tournez brièvement vers le bas (1 000 x g, 5 sec) et incubez à RT pendant au moins 20 min et jusqu’à 2 h.
- Pipetez doucement 20 μl de complexe de transduction sur le côté des puits de biocapteurs individuels. Utilisez trois répliques techniques, si possible. Retournez les cellules traitées dans l’incubateur pendant 24 à 48 heures. Incuber dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 3.6.
note: La condition de contrôle négatif appropriée pour cette configuration est que les cellules de biocapteur sont traitées avec des liposomes vides (c’est-à-dire un réactif de liposome + un milieu sérique réduit), car l’application de phospholipides introduit un léger décalage dans le profil de fluorescence par rapport aux cellules de biocapteur non exposées au réactif de liposome.
5. Collecte de cellules pour la cytométrie en flux FRET
REMARQUE : Avant de prélever les cellules, généralement 24 à 48 heures après le traitement, il est possible d’obtenir une lecture préliminaire de l’activité d’ensemencement à l’aide du filtre à protéine fluorescente verte (GFP) sur un microscope à fluorescence inversée standard. Les cellules traitées sans matériel d’origine (c’est-à-dire des liposomes vides) présenteront une fluorescence diffuse, tandis que les cellules traitées avec du matériel d’origine présenteront des inclusions intracellulaires ponctuées et réticulaires intenses (Figure 1A-B).
- À l’aide d’une pipette multicanaux, aspirer tout le milieu cellulaire (150 μl). Trypsiniser les cellules (50 μl) pendant 5 min et tremper avec un milieu de culture réfrigéré de 150 μl. N’incluez pas de rinçage PBS avant la trypsinisation à cette étape, car cela pourrait provoquer un soulèvement des cellules et une perte de cellules ultérieure. Excluez les cellules mortes et les débris contaminants lors de la cytométrie en flux grâce à des stratégies de contrôle.
- Immédiatement après la trempe, transférez les cellules sur une plaque inférieure ronde à 96 puits et centrifugez-les à 1 000 x g pendant 5 min à RT.
- Aspirez et jetez le milieu en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire.
- Doucement, mais soigneusement, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 50 μl de paraformaldéhyde à 2 % et incubez pendant 10 min. Sinon, faites fonctionner les cellules en direct, bien que la fixation donne des résultats plus propres et plus cohérents.
- Centrifugez les cellules à 1 000 x g pendant 5 min à RT. Aspirez et jetez le paraformaldéhyde en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire.
- Doucement, mais soigneusement, remettez la pastille cellulaire en suspension dans un tampon de cytométrie en flux réfrigéré de 200 μl (solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), 1 % FBS, 1 mM d'EDTA) et faites fonctionner la plaque dès que possible pour éviter l'agglutination des cellules.
6. Cytométrie en flux FRET
REMARQUE : Utilisez un cytomètre en flux tel que le MACSQuant VYB, qui est équipé de lignes laser et d’ensembles de filtres compatibles FRET (Tableau 2). Pour chaque étape de cette section, cliquez sur le puits qui vous intéresse à l'aide du modèle de 96 puits du logiciel, puis cliquez sur « jouer » pour commencer l'absorption et le flux de l'échantillon. Faites des graphiques ou des tableaux de statistiques en cliquant sur l'icône « nouvelle fenêtre d'analyse ». Modifiez les paramètres de l’axe sur des tracés bivariés individuels en cliquant sur le titre de l’axe X ou Y et en sélectionnant le filtre approprié. Pour déplacer les populations de cellules ou les signaux de fluorescence, augmentez ou diminuez les tensions associées aux filtres appropriés. Avec cet instrument, exécutez <1 000 événements/s pour assurer une surveillance précise d’une seule cellule.
- Faites un graphique bivarié entre l’aire de diffusion latérale (SSC-A) et l’aire de diffusion vers l’avant (FSC-A) et, avec la ligne cellulaire #1 en cours, ajustez les tensions SSC et FSC jusqu’à ce que la population cellulaire se trouve dans le quadrant inférieur gauche. Cliquez sur l’outil Polygone et définissez la population de cellules (Gate P1). Pour tous les paramètres de déclenchement, reportez-vous à la figure 2.
- Faites un graphique bivarié FSC-H (hauteur) vs FSC-A, et appliquez la porte P1 à ce graphique en cliquant sur « live » au-dessus du graphique et en sélectionnant P1. Avec la ligne de cellule #1 en cours d’exécution, cliquez sur l’outil polygone et définissez des cellules uniques (Porte P2).
- Faites 3 graphiques d’histogramme, un pour chacun des filtres d’intérêt : CFP, YFP et FRET. Appliquez le point de contrôle P2 à tous ces tracés en cliquant sur « en direct » au-dessus des tracés et en sélectionnant P2. Avec la lignée cellulaire #1 en marche, ajustez les tensions de sorte que la population cellulaire médiane dans les histogrammes CFP, YFP et FRET soit comprise entre 0 et 1. Pour mesurer la CFP et la FRET, excitez les cellules avec le laser 405 nm et capturez la fluorescence avec un filtre 450/50 nm et 525/50 nm, respectivement. Pour mesurer YFP, excitez les cellules avec un laser de 488 nm et capturez la fluorescence avec un filtre de 525/50 nm. Les paramètres du laser et du filtre sont décrits plus en détail dans le Tableau 2.
- Effectuer une compensation pour le débordement CFP dans les canaux FRET et YFP.
note: La compensation est le processus de correction du débordement de fluorescence. Le débordement de fluorescence se produit chaque fois que l’émission de fluorescence d’un fluorochrome est détectée à l’intérieur d’un filtre conçu pour mesurer le signal d’un autre fluorochrome. Avec une compensation appropriée, la fluorescence de débordement CFP peut être éliminée des canaux FRET et YFP.
note: La compensation nécessite la présence de cellules positives et négatives à la fluorescence. Ainsi, pour compenser les cellules CFP-positives (lignée cellulaire #2), des cellules négatives (lignée cellulaire #1) doivent être ajoutées à l’échantillon avant l’analyse.
- Injectez 30 μl de suspension de la lignée cellulaire #1 à partir d’un seul puits dans 200 μl de suspension de la lignée cellulaire #2 immédiatement avant de compenser.
- Cliquez sur l'icône « Paramètres de l'instrument », puis sur l'onglet « Compensation », et cochez « Matrice » pour ouvrir la table de compensation.
- Effectuez un tracé bivarié FRET-A vs CFP-A et appliquez la porte P2, comme décrit à l’étape 6.3. Avec les lignées cellulaires 1+2 en cours d'exécution, cliquez sur l'icône « quadrant » et dessinez des quadrants de sorte que les populations négatives et positives à la fluorescence soient séparées par les deux quadrants inférieurs (portes LL3 et LR3, respectivement).
- Créez un tableau de statistiques qui affiche l’intensité de fluorescence médiane (MFI) de FRET pour les portes LL3 et LR3. Ajustez le paramètre FRET dans la matrice de compensation jusqu’à ce que le MFI du signal FRET soit équivalent entre LL3 et LR3. Suite à cette étape, le MFI du signal FRET est égal entre les cellules non colorées et les cellules CFP-positives, ce qui suggère l’absence de débordement de CFP dans le canal FRET.
- Effectuez un tracé bivarié YFP-A vs CFP-A et appliquez la porte P2, comme décrit à l’étape 6.3. Dessinez des quadrants (LL4 et LR4) similaires à ceux de l’étape 6.4.3.
- Créez un tableau de statistiques qui affiche l’IFM de YFP pour LL4 et LR4. Ajustez le paramètre YFP dans la matrice de compensation jusqu’à ce que le MFI du signal YFP soit équivalent entre LL4 et LR4. Après cette étape, la MFI d’un signal YFP est égale entre les cellules non colorées et les cellules CFP positives, ce qui suggère l’absence de débordement de CFP dans le canal YFP.
- Après la configuration de la porte et la compensation, mettez en évidence les puits d’intérêt et analysez le reste de la plaque.
- Une fois tous les échantillons exécutés, exportez les fichiers de données en cliquant sur « fichier », puis sur « copier ». Sélectionnez l'onglet « Fichiers de données », mettez en surbrillance le dossier de l'expérience, puis cliquez sur « Copier ».
