Technique d’évaluation de l’effet inhibiteur de l’exposition à des toxines sur les courants postsynaptiques excitateurs miniatures (mEPSC)

Résumé

Source : Hubbard, K. et. al., Évaluation fonctionnelle des neurotoxines biologiques dans des cultures en réseau de neurones du système nerveux central dérivés de cellules souches.J. Vis. Exp. (2015)

La vidéo montre l’analyse électrophysiologique de neurones dérivés de cellules souches embryonnaires après exposition à des neurotoxines. Le traitement de ces neurones avec des neurotoxines botuliques réduit la fréquence des courants post-synaptiques excitateurs miniatures spontanés, confirmant l’inhibition de la transmission synaptique.

Protocole

1. Adaptation des cellules souches embryonnaires (CSE) à la culture en suspension sans cellules nourricières

1. Décongeler les ESC à 37 °C jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un éclat de glace.
2. À l’aide d’une pipette P1000, transférez délicatement 1 - 2,5 x 10⁶ ESC dissociés dans une boîte non traitée pour la culture tissulaire contenant 10 ml de milieu ESC préchauffé. Incuber dans un incubateur de culture tissulaire humidifié pendant 20 heures à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone (CO₂).
3. Après 20 heures, laver les cellules en transférant doucement la culture en suspension dans un tube conique de 15 ml à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Granulés ESC pendant 3 min à 200 x g. Pendant l’essorage, ajoutez 10 ml de plat frais ESC à adhérence moyenne à faible.
4. Aspirez le surnageant, en prenant soin de ne pas déloger la pastille cellulaire, et ajoutez 1 ml de milieu ESC frais à la pastille cellulaire. Transférez les cellules dans la boîte bactérienne à l’aide d’une pipette P1000 et retournez-les dans l’incubateur.
5. Observez les cellules tous les jours jusqu’à ce que les agrégats deviennent visibles à l’œil nu (généralement de 4 à 8 jours (j) ; les agrégats mesurent de 0,2 à 0,5 mm). Si les agrégats ne sont pas apparents après 4 jours, répétez l’étape 1.3. Une fois que les agrégats sont visibles, dissocier et maintenir les ESC comme décrit à la section 2.

2. Passage et maintenance de l’ESC

1. Transférez les agrégats ESC dans un tube conique de 15 ml à l’aide d’une pipette stérile de 10 ml et laissez les agrégats se déposer en une pastille compacte (généralement 3 à 5 min). Aspirez le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire, et lavez les agrégats avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Bien qu’il soit recommandé de déposer des granulés à 100 x g pendant 2,5 minutes pour gagner du temps.
2. Aspirez le PBS et ajoutez 500 μl de trypsine. Incuber les agrégats dans la trypsine pendant 3 min dans un bain-marie à 37 °C. Ajouter 500 μl de milieu ESC pour diluer la trypsine et triturer doucement 10 fois avec une pipette P1000 pour briser les agrégats. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
3. Les granulés dissocient les cellules pendant 3 min à 200 x g et remettent les cellules en suspension à une concentration finale de 1,0 x 10⁷ cellules/ml dans un milieu ESC. Transvaser 150 μl (1,5 x 10⁶ cellules) dans 10 ml de milieu ESC frais dans une boîte bactérienne de 10 cm et retourner dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 48 heures. Les CSE en excès peuvent être différenciés, cryoconservés à 1 - 5 x 10⁶ cellules/ml dans un milieu à 90 % ESC complété par 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO), ou jetés.
4. Les agrégats de passage seront clairement visibles, avec des diamètres supérieurs à 0,5 mm.
   note: La décongélation et la culture de cellules cryopréservées et adaptées à la suspension sont réalisées selon les étapes 1.2 à 1.4. Les granulats seront prêts à être passés dans un délai de 48 à 72 heures.

3. Différenciation neuronale

REMARQUE : Effectuez les étapes 3.1 à 3.5 avant midi et l’étape 3.7 après midi. La figure 1A présente un aperçu des procédures de différenciation.

1. Dissociez les ESC comme aux étapes 2.1 à 2.5. Transvaser 350 μl (3,5 x 10⁶) de CEE dissociés dans une boîte de 10 cm à faible fixation contenant 25 ml de milieu de différenciation. Placer sur un agitateur orbital réglé à 30 - 45 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂. C’est le premier jour de différenciation, appelé jour in vitro (DIV) -8.
   note: L’utilisation d’une boîte de Pétri à très faible fixation augmente le coût de la méthode, mais produit des rendements légèrement plus importants que les boîtes de Pétri bactériennes, car les agrégats peuvent parfois adhérer aux boîtes de Pétri. Les volumes moyens et les nombres de cellules peuvent être mis à l’échelle en conséquence si différentes tailles de parabole sont préférées.
2. Après 48 heures (DIV -6), à l’aide d’une pipette de 25 ml, transférer les agrégats cellulaires différenciateurs dans un tube conique de 50 ml. Ajouter immédiatement 25 ml de milieu de différenciation frais dans la boîte de Pétri.
3. Laisser les agrégats se déposer pendant 2 à 5 minutes, produisant une pastille visible de 1 à 2 mm de profondeur. Ignorez les cellules simples ou les petits agrégats restant en suspension. Aspirez soigneusement le milieu et transférez la pastille cellulaire dans la boîte de Pétri à l’aide d’un P1000. Placer sur un agitateur rotatif dans un incubateur de culture tissulaire.
4. À DIV -4, répétez l’étape 3.2. Le granulé aura une profondeur de 2 à 4 mm. Remplacer 30 ml de milieu de différenciation complété par 6 μM d’acide rétinoïque trans (AR) dans la boîte de Pétri. Retournez dans l’agitateur rotatif de l’incubateur de culture tissulaire pendant 48 heures supplémentaires.
5. À DIV -2, répétez l’étape 3.3. La granule aura une profondeur de 4 à 8 mm à ce stade.
6. À DIV -1, préparer les surfaces de placage comme dans la section 4.
7. À la DIV 0, décongeler 5 ml de milieu de trypsinisation des cellules neurales progénitrices (NPC) pré-aliquote et congelé à 37 °C pendant 5 à 10 minutes et les placer dans une hotte de culture tissulaire. À l’aide d’une pipette de 25 ml, transférez les agrégats différenciateurs dans un tube conique de 50 ml. Laissez les agrégats se déposer et aspirez soigneusement le fluide. Lavez le granulé deux fois avec 10 ml de PBS, en laissant les agrégats se déposer entre les lavages.
8. Après le deuxième lavage PBS, ajoutez 5 ml de milieu de trypsinisation NPC à la pastille et incubez à 37 °C pendant 5 min. Retournez doucement le tube après 2,5 min.
9. Ajouter 5 ml d’inhibiteur de la trypsine de soja (IST) à 0,1 % pour inactiver la trypsine et mélanger en inversant. Triturer doucement 10 à 15 fois avec une pipette sérologique de 10 ml jusqu’à ce qu’une suspension cellulaire relativement homogène soit produite.
10. Transférez lentement la suspension cellulaire dans une crépine cellulaire de 40 μm ou 70 μm placée sur le dessus d’un tube conique de 50 ml. Une fois que toute la suspension a été filtrée, ajoutez 1 ml de milieu N2 pour laver les cellules restantes à travers le filtre et granulez la suspension cellulaire dissociée pendant 6 min à 200 x g.
11. Aspirer le milieu sans perturber le granulé. Laver les cellules deux fois avec un milieu N2 de 10 ml, les cellules de granulés pendant 5 min à 200 x g et triturer entre les lavages avec un P1000. Avant le deuxième lavage, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
12. Remettre en suspension les cellules dans le milieu N2 à raison de 1 x 10⁷ cellules par ml et mettre en boîte des neurones dérivés de cellules souches embryonnaires (ESN) à une densité cellulaire de 150 000 à 200 000 cellules/^cm2.
13. Transvaser les NSE nouvellement placés dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ et les maintenir comme indiqué à la section 5.

4. Préparation des surfaces de culture pour le placage des précurseurs neuronaux au DIV 0

1. Préparez des plats traités pour la culture tissulaire au moins 1 jour avant le placage. Ajouter suffisamment de polyéthylèneimine (PEI ; 25 μg/ml dans le H₂O stérile) ou de poly-D-lysine (PDL ; 100 μg/ml dans le H₂O stérile) pour couvrir les boîtes en plastique traitées par culture tissulaire et incuber O/N à 37 °C.
2. Le matin du dressage, laver la vaisselle deux fois avec du H₂O double distillé et une fois avec du PBS. Après le lavage final, ajoutez suffisamment de milieu N2 pour couvrir le plat (par exemple, 1 ml par puits d’un plat à 12 puits ou 4 ml par plat de 6 cm).
3. Préparez des lamelles en verre de 18 mm au moins un jour avant le placage des neurones. Nettoyez les lamelles par nettoyage au plasma pendant 4 min.
4. Transférez immédiatement les lamelles nettoyées dans un parafilm lavé à l’éthanol au fond d’une grande boîte stérile et ajoutez 400 μl de solution PEI ou PDL, préparée comme à l’étape 4.1. Incuber toute la nuit (O/N) à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire.
5. Le matin, laver les lamelles trois fois avec de l’eau et ajouter 5 μg/ml de laminine dans du PBS pendant 1 à 3 heures à 37 °C. Avant de dissocier les neurones, aspirez la laminine et transférez immédiatement la lamelle dans un puits d’une boîte à 12 puits contenant 1 ml de milieu NPC, en veillant à garder le côté traité vers le haut.
6. Conservez la vaisselle et les lamelles à 37 °C jusqu’à ce que les PNJ soient prêts à servir.

5. Maintenance des neurones

1. Au DIV 1, aspirer le milieu et le remplacer par le milieu de culture N2.
2. Aux DIV 2 et 4, aspirer le milieu et le remplacer par du milieu de culture B27.
3. À la DIV 8, aspirer le milieu et le remplacer par un milieu de culture B27 contenant des inhibiteurs mitotiques pour éliminer les cellules non neuronales contaminantes.
4. À la DIV 12, remplacer par un milieu de culture B27.
5. Ne retirez pas les ESN DIV 12⁺ de 5 % de CO₂ avant d’être prêt.

6. Dosage de l’inhibition mesurée de la transmission synaptique (MIST) pour la quantification des courants post-synaptiques excitateurs miniatures

ATTENTION : Les neurotoxines clostridiennes sont les substances les plus toxiques connues, avec des valeurs DL₅₀ humaines estimées aussi faibles que 0,1 - 1 ng/kg. Obtenez les approbations nécessaires avant d’utiliser ces toxines et prenez les précautions appropriées.

1. Diluez soigneusement BoNT/A à 100x, la concentration finale souhaitée dans le milieu de culture ESN, et réchauffez à 37 ºC. Ajoutez le volume approprié de toxine aux cultures DIV 21+ ESN, faites tourner la boîte de culture et retournez dans l’incubateur.
2. Si les cellules doivent être analysées plus de 4 heures après l’intoxication, ajoutez une toxine dans la boîte et faites tourbillonner sans retirer de 5 % de CO₂, comme directement dans l’incubateur ou dans une chambre à CO₂ constant.
3. Au moment approprié, aspirez le milieu de culture ESN et lavez-le deux fois avec un tampon d’enregistrement extracellulaire (ERB). Ajouter 4 ml d’ERB complété par 5,0 μM de tétrodotoxine et 10 μM de biculline, bloquant les potentiels d’action et antagonisant l’activité du récepteur GABA_A, respectivement.
4. Transférez la parabole dans le dispositif d’électrophysiologie. Ni la perfusion ni le contrôle de la température ne sont nécessaires pour le test MIST.
5. Tirez le verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de micropipette pour produire une pipette d’enregistrement avec une résistance de 5 à 10 mΩ et remplissez-la d’un tampon d’enregistrement intracellulaire. Trempez doucement la pipette d’enregistrement remplie dans le réactif de siliconation avant l’enregistrement.
6. À l’aide d’une seringue remplie d’air, fournir une pression positive pendant que la pipette d’enregistrement est abaissée dans l’ERB. Après avoir posé doucement la pipette d'enregistrement sur le soma du neurone à enregistrer, retirez la pression positive et formez un gigaseal. Diminuez la tension de maintien à -70 mV. Appliquez soigneusement une pression négative pour entrer dans la configuration de cellules entières.
7. Passez à la pince de courant pour surveiller et enregistrer le potentiel de la membrane de repos. Sans ajustement pour les potentiels de jonction liquide, le potentiel de la membrane au repos sera compris entre -67 et -82 mV.
8. Effectuez un enregistrement continu par pince de tension de -70 mV pendant 4 à 5 min pour détecter les courants post-synaptiques excitateurs miniatures (mEPSC).
9. Analysez 4 min de données enregistrées pour la détection mEPSC à l’aide d’un logiciel de détection de pointes avec les paramètres suivants : Seuil, 5 ; Période de recherche locale maximale, 10 000 μsec ; Temps avant un pic pour la ligne de base, 5 000 μsec ; Période de recherche d’un temps de décroissance, 20 000 μsec ; Fraction du pic pour trouver un temps de décroissance, 0,37 ; Période de calcul de la moyenne d’une ligne de base, 1 000 μs ; Seuil de surface, 20 ; Nombre de points jusqu’au sommet moyen, 1 ; Direction du pic, négative.
10. Collectez et enregistrez des informations sur les événements détectés. Divisez le nombre d’événements détectés en 4 min par 240 pour déterminer la fréquence mEPSC en Hz.
11. Recueillir les fréquences mEPSC pour 8 à 12 témoins et 8 à 12 échantillons traités au BoNT pour chaque condition d’exposition. Analysez la fréquence par rapport aux témoins appariés selon l’âge et le lot. Déterminez la signification statistique du pourcentage d'inhibition de l'activité synaptique à l'aide de l'ANOVA à un facteur et du test post-hoc de Dunnett.

Résultats

Graphique 1. Les ESN adaptés à la suspension restent mitotiquement stables et expriment des marqueurs de pluripotence.A) Schéma de maintenance et de différenciation de l’ESC. La présence ou l’absence d’acide rétinoïque (PR) ou de facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) est marquée par un + ou un –. Une comparaison entre les jours in vitro (DIV) et les stades classique...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tableau 1. ESC et ESN
DMEM KO	Technologies de la vie	Référence 10829-018	Média : Milieu de culture ESC
			Formulation et notes : 500 mL
100x MEM NEAA	Technologies de la vie	Référence 11140-050	Milieu : conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois
			Formulation et notes : 6 mL
200 mM de L-alanyl-L-glutamine	ATCC	30-2115	6 mL
Qualifié ES FBS	Cellules souches appliquées	ASM-5007	90 ml
100x antibiotiques	Sigma-Aldrich	A5955	3 ml
55 mM de 2-mercaptoéthanol	Technologies de la vie	Référence 21985-023	1,1 mL
107 unités/mL LIF	Millipore	ESG1107	60 μL
DMEM KO	Technologies de la vie	Référence 10829-018	Média : Média de différenciation ESC
			Formulation et notes : 436,6 mL
100x MEM NEAA	Technologies de la vie	Référence 11140-050	Milieu : conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois
			Formulation et notes : 5 mL
200 mM de L-alanyl-L-glutamine	ATCC	30-2115	5 mL
Sérum qualifié ESC	Cellules souches appliquées	ASM-5007	50 ml
100x antibiotiques	Sigma-Aldrich	A5955	2,5 ml
55 mM de 2-mercaptoéthanol	Technologies de la vie	Référence 21985-023	0,9 mL
Le PBS de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Milieu : Milieu de trypsinisation NPC
			Formulation et notes : 100 mL
0,5 M EDTA (18,3 %)	Sigma-Aldrich	Référence 3690	Milieu : congeler dans 5 mL d’aliquote
			Formulation et notes : 0,266 mL
trypsine	Sigma-Aldrich	Réf. T8802	50 mg
Polyéthylèneimine (PEI)	Sigma-Aldrich	Réf. P3143	Supports : Solutions de revêtement de surface
			Formulation et notes : 2,5 μg/mL dans H20
Poly-D-lysine (PDL)	Sigma-Aldrich	P7280	Média : utilisation dans 1 semaine
			Formulation et notes : 100 μg/mL dans H20
Laminine	Sigma-Aldrich	L2020	5 μg/mL dans H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Technologies de la vie	Référence 10565-018	Média : Milieu de culture NPC
			Formulation et notes : 492,5 mL
100x vitamines N2	Technologies de la vie	Référence 17502-048	Milieu : conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois
			Formulation et notes : 5 mL
100x antibiotiques	Sigma-Aldrich	A5955	2,5 ml
Neurobasale A	Technologies de la vie	Référence 10888-022	Média : Média culturel ESN
			Formulation et notes : 482,5 mL
50x vitamines B27	Technologies de la vie	Référence 17504-044	Milieu : conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois
			Formulation et notes : 10 mL
200 mM de L-alanyl-L-glutamine	ATCC	30-2115	5 mL
100x antibiotiques	Sigma-Aldrich	A5955	2,5 ml
5-fluoro-2'-désoxyuridine (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Milieu : 2000x inhibiteurs de mitoses aliquote et stockage à -20 °C
			Formulation et notes : dd 150 mg 5FDU et 350 mg d’uridine pour 10 mL Neurobasal A. Filtre stérile, aliquote et congélation. Utiliser 2000x dans le milieu de culture ESN.
uridine	Sigma-Aldrich	Référence U3003
TrypLE Express Trypsine	Technologies de la vie	Référence 12605-010	Médias : Divers
			Formulation et notes : à conserver chez RT
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	magasin chez RT
Inhibiteur de la trypsine de soja (ITS)	Sigma-Aldrich	Réf. T6414	conserver à -20 °C
éthanol	Sigma-Aldrich	E7023	magasin chez RT
acide ascorbique	Sigma-Aldrich	A4403	Préparez un bouillon de 100 mM en dissolvant 100 mg d’acide ascorbique dans 5,7 mL d’un mélange 50:50 de DMSO et d’éthanol.
Acide rétinoïque (AR)	Sigma-Aldrich	R2625	Mettre à nouveau en suspension 15 mg d’AR dans 9 mL de DMSO 50:50/éthanol. Complétez avec 1 ml de bouillon d’acide ascorbique de 100 mM. Aliquote et stocké à -80 °C. Stable pendant 6 mois.
Tableau 2. Brume
NaCl	Sigma-Aldrich	Référence 71386	Support : Tampon d’enregistrement extracellulaire
			Concentration finale (mM) : 58,44
			MW : 140
Kcl	Sigma-Aldrich	Référence 60135	Milieu : (ERB ; pH = 7,3, 315 mO)
			Concentration finale (mM) : 74,56
			MW : 3,5
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139	Milieu : Stable à 4 °C pendant au moins 6 mois.
			Concentration finale (mM) : 119,98
			MW : 1,25
CaCl2	Sigma-Aldrich	Référence 21115	Concentration finale (mM) : 110,98
			MW : 2
MgCl2	Sigma-Aldrich	Référence 63069	Concentration finale (mM) : 95,21
			MW : 1
D-glucose	Sigma-Aldrich	Référence G8644	Concentration finale (mM) : 180,16
			MW : 10
HEPES	Sigma-Aldrich	N° H0887	Concentration finale (mM) : 238,3
			MW : 10
K-gluconate	Sigma-Aldrich	P1847	Support : Tampon d’enregistrement intracellulaire
			Concentration finale (mM) : 234,5
			MW : 140
NaCl	Sigma-Aldrich	Référence 71386	Milieu : (IRB ; pH = 7,3, 320 mO)
			Concentration finale (mM) : 58,44
			MW : 5
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Milieu : Stable à 4 °C pendant au moins 6 mois.
			Concentration finale (mM) : 507,18
			MW : 2
Li-GTP	Sigma-Aldrich	Référence G5884	Concentration finale (mM) : 523,18
			MW : 0,5
CaCl2	Sigma-Aldrich	Référence 21115	Milieu : Stable à 4 °C pendant au moins 6 mois.
			Concentration finale (mM) : 110,98
			MW : 0,1
MgCl2	Sigma-Aldrich	Référence 63069	Milieu : Stable à 4 °C pendant au moins 6 mois.
			Concentration finale (mM) : 95,21
			MW : 1
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	380.35 Milieu : Stable à 4 °C pendant au moins 6 mois < > Concentration finale (mM) : 380,35 MW : 1
HEPES	Sigma-Aldrich	N° H0887	Milieu : Stable à 4 °C pendant au moins 6 mois.
			Concentration finale (mM) : 238,3
			MW : 10
Bicuculline	Tocris	131	Médias : Divers
			Concentration finale (mM) : 0,01
			MW : 417,85
CNQX	Sigma-Aldrich	Réf. C239	Concentration finale (mM) : 0,01
			MW : 276,12
Tétrodotoxine	Sigma-Aldrich	A8001	Concentration finale (mM) : 0,005
			MW : 645,74
BoNT/A-/G	Métabiologiques	n/a	média:
			Concentration finale (mM) : À déterminer
			MW : 150 000
Toxine tétanique	Sigma-Aldrich	Réf. T3194	Concentration finale (mM) : À déterminer
			MW : 150 000
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2	Concentration finale (mM) : N/A
			MW : S.O.
Tableau 3. Équipement et logiciels
MiniAnalysis (version 6.0.7)	Synaptosoft, Inc.	n/a	Logiciel de détection d’événements
Igor Pro (version 6.22A)	WaveMetrics (en anglais)	n/a	Logiciel de visualisation des enregistrements
Maître des patchs	Heka	n/a	Logiciel d’acquisition de données
Microscope inversé Olympus IX51	Olympe	n/a
Micromanipulateur	Instrument Sutter	MPC-365
Amplificateur patch-clamp	Heka	ECB10USB
Extracteur de micropipette	Instrument Sutter	P-1000
Tubes capillaires en borosilicate	Instrument Sutter	Réf. B150-86-10	Corning 7740
Lamelles en verre de 18 mm	pêcheur	Tél. : 12-545-84
Nettoyeur plasma	Plasma de Harrick	PDC-32G
Crépine cellulaire (40 μm)	pêcheur	Référence 08-771-1
Stovall Danseuse du Ventre Shaker	pêcheur	Tél. : 15-453-211
Plats à faible adhérence	pêcheur	Tél. : 05-539-101	Corning 3262
Boîtes bactériennes	VWR	Référence 25384-302	100 x 15 millimètre