Production d’anticorps à partir d’une culture de prolifération discontinue de cellules de mammifères transfectées

Résumé

Source : Elgundi, Z. et al., Production et purification à l’échelle du laboratoire d’un anticorps thérapeutique.J. Vis. Exp.(2017)

La vidéo présente une méthode de production d’anticorps thérapeutiques à l’aide de cellules de mammifères transfectées de manière stable. La supplémentation en tryptone stimule la division cellulaire, ce qui entraîne une prolifération et favorise un rendement en anticorps plus élevé. Le milieu contenant des anticorps est récolté, filtré et stocké pour une utilisation ultérieure.

Protocole

REMARQUE : Un vecteur d’expression de mammifère approprié doit être utilisé pour ce protocole. Ici, une seule construction contenant deux cassettes d’expression est utilisée (c’est-à-dire que l’expression en chaîne lourde et légère est entraînée par des promoteurs distincts). Des chaînes lourdes et légères de trastuzumab ont déjà été clonées dans le vecteur. Ce vecteur est un don d’Andrew Beavil, obtenu par l’intermédiaire d’un dépôt de plasmides à but non lucratif.

1. Récupération et mise à l’échelle de l’ADN vectoriel

REMARQUE : L’ADN du vecteur a été reçu sous forme de culture de gélose molle dans la souche Escherichia coli XL-1 Blue ; le vecteur est résistant à l’hygromycine.

1. Insérer une languette ou une boucle d’inoculation stérile dans la gélose molle de la culture à couteaux, puis strier une plaque de gélose Luria Bertani (LB) préparée avec 75 μg/ml d’hygromycine pour les colonies isolées. Incuber la plaque à 37 °C pendant 18 à 24 heures.
2. Inoculer une seule colonie dans 5 ml de bouillon Terrific (TB) contenant 75 μg/ml d’hygromycine. Incuber la culture à 37 °C pendant 18 à 24 heures en secouant à 225 tr/min.
3. Utilisez la culture de nuit pour préparer un stock de glycérol d’ADN vecteur en mélangeant doucement 800 μl de culture avec 200 μl de glycérol à 80 % dans un cryoflacon et congelez à -80 °C.
   1. Ajouter 100 μl de la culture de nuit à 100 ml de TB contenant 75 μg/ml d’hygromycine dans un flacon agitateur à chicanes (c.-à-d. dilution de 1/1 000). Incuber la culture à 37 °C pendant 18 à 24 heures en secouant à 225 tr/min.
4. Après une culture nocturne, extrayez et purifiez l'acide nucléique (ADN) désoxyribose selon les instructions du fabricant pour le kit de préparation midi/maxi, à l'exception suivante : au cours de l'étape finale, éluez ou remettez en suspension l'ADN avec de l'eau (pH 7,0-8,5).
5. Vérifiez la concentration et la pureté de l’ADN par des lectures d’absorbance à 260 et 280 nm, puis stockez l’ADN à -20 °C.
   REMARQUE : Facultatif (fortement recommandé) : Séquencez l’ADN à l’aide d’amorces spécifiques au vecteur pour confirmer l’identité.

2. Transfection stable des cellules HEK-293

1. Cultiver et entretenir des cellules HEK-293 (cellules en suspension) selon les protocoles standard dans des milieux sans sérum complétés par 0,1 % de tensioactif non ionique dans des fioles Erlenmeyer. Maintenir à 2 x 10⁵ cellules/ml et sous-culture tous les quatre jours. Cellules de culture à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone (CO₂) et rotation à 120 tr/min.
   REMARQUE : Les cellules doivent avoir été en culture pendant au moins 4 jours et pas plus de 4 semaines avant la transfection. Les cellules HEK-293 cultivées en monocouches dans des milieux contenant du sérum peuvent également être utilisées pour cette procédure.
2. La veille de la transfection, ensemencer les cellules HEK-293 à raison de 3 x 10⁵ cellules/ml dans des puits d'une plaque à 12 puits dans 2 ml de milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur. Le jour de la transfection, vérifiez que les cellules ont atteint 80-90 % de confluence
3. Diluez l’ADN et la polyéthylénamine (PEI) séparément dans le milieu de transfection, puis mélangez-les.
   1. Diluer 1,25 μg d’ADN vecteur par puits (15 μg pour 12 puits) dans un milieu de transfection de 300 μl. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
   2. Diluer 2,5 μl d’une solution de PEI à 1 mg/ml (30 μl pour 12 puits, c’est-à-dire un rapport ADN/PEI de 1:2) dans un milieu de transfection de 300 μl. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
   3. Ajouter l’ADN dilué à l’IPE dilué, mélanger doucement et incuber à température ambiante pendant 15 min.
4. Ajouter 50 μl de mélange ADN/PEI goutte à goutte dans chaque puits de la plaque. Basculez doucement la plaque pour répartir le mélange de transfection, puis placez la plaque à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 24 heures.
5. Ajouter 50 μg/ml d’hygromycine B par puits et ramener la plaque à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 10 jours.
   REMARQUE : Au jour 10, les cellules non transfectées seront mortes et détachées de la surface de la plaque, tandis que les cellules transfectées de manière stable seront viables et attachées à la plaque.
6. Remplacer le milieu dans les puits par un milieu sans sérum de 1/4 de volume et un volume de DMEM complété par 10 % de FBS (c’est-à-dire 0,5 ml de milieu sans sérum + 1,5 ml de DMEM = 7,5 % de concentration sérique finale) et incuber pendant 4 jours.
7. Remplacer le milieu dans les puits par un milieu sans sérum de 1/2 volume et un volume de DMEM complété par 10 % de FBS (c’est-à-dire 1 ml de milieu sans sérum + 1 ml de DMEM = concentration sérique finale de 5 %) et incuber pendant 4 jours.
8. Remplacer le milieu dans les puits par un milieu sans sérum de volume 3/4 et un milieu DMEM 1/4 volume complété par 10 % de FBS (c’est-à-dire 1,5 ml de milieu sans sérum + 0,5 ml de DMEM = concentration sérique finale de 2,5 %) et incuber pendant 4 jours.
9. Remplacer le milieu dans les puits par 2 ml de milieu sans sérum complété par un tensioactif non ionique à 0,1 % (c’est-à-dire 0 % de concentration sérique finale) et incuber pendant 4 jours><. REMARQUE : Maintenir une pression sélective de 50 μg/ml d’hygromycine B sur les cellules pendant l’adaptation sans sérum. Les cellules adaptées aux milieux sans sérum se détachent de la surface des puits et peuvent se regrouper en suspension. Reportez-vous à l’étape 2.1 pour les conditions de culture avec le supplément supplémentaire de 50 μg/ml d’hygromycine B.
10. À l’aide d’une pipette, mélangez délicatement les cultures en suspension dans la plaque à 12 puits et les cellules de pool dans un tube séparé.
    1. À l’aide d’un hémocytomètre, dénombrer les cellules regroupées et les semer dans un milieu sans sérum de 30 ml dans un erlenmeyer à raison de 2 x 10⁵ cellules/ml. Cellules de culture à 37 °C avec 5 % de CO₂ et rotation de 120 tr/min. Sous-culture et se développer tous les quatre jours.
11. Continuer à augmenter la taille de la culture à la densité cellulaire requise pour obtenir 10 flacons à 1 x 10⁷ cellules/flacon pour la cryoconservation dans l’azote liquide. Congelez les cellules dans un milieu sans sérum contenant 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO).
    REMARQUE : Des milieux conditionnés contenant des anticorps peuvent être récoltés à chaque sous-culture pour confirmer la production de protéines ou utilisés pour optimiser les conditions de purification. Pour récolter des milieux conditionnés et maintenir les cellules pour la sous-culture, centrifuger la culture à 300 x g pendant 5 min, puis filtrer-stériliser le surnageant à travers un filtre de 0,22 μm. Le surnageant filtré peut être conservé à 4 °C pendant 1 à 2 semaines ou à -20 °C pour un stockage à plus long terme.

3. Production d’anticorps à grande échelle à partir d’une culture par prolifération en lots

REMARQUE : La production d’anticorps peut être suivie à partir de l’étape 2.11, où les cellules existantes sont étendues à la densité cellulaire requise en fonction du volume de culture de surcroissance du lot à configurer. Sinon, les cellules qui ont été décongelées de la cryoconservation commencent à ce stade une fois qu’elles ont atteint une densité et un volume cellulaires appropriés. Divers suppléments de culture peuvent être utilisés pour optimiser la production d’anticorps ; L’utilisation du tryptone pour augmenter le rendement en anticorps est démontrée dans ce protocole.

1. Cellules germinales à raison de 2 x 10⁵ cellules/ml dans un milieu sans sérum de 100 ml dans deux flacons Erlenmeyer (pour comparer les rendements en anticorps de cultures non supplémentées et enrichies en nutriments). Culture à 37 °C, 5 % CO₂ et 120 tr/min.
2. Après 24 heures, ajoutez du tryptone à une concentration finale de 0,5 % à la culture enrichie en nutriments. Égalisez le volume de culture non supplémentée avec des milieux sans sérum.
3. À partir du 8e jour, effectuez quotidiennement le comptage cellulaire des cultures à l’aide d’un hémocytomètre pour surveiller la viabilité cellulaire. Récoltez les surnageants de culture une fois que la viabilité cellulaire est inférieure à 80 %.
   1. Récolter le surnageant par centrifugation des cultures à 3 000 x g pendant 15 min, puis filtrer et stériliser le surnageant (contenant l’anticorps) à travers un filtre de 0,22 μm. Stockez les surnageants à 4 °C (à court terme) ou congelez-les à -20 °C (à long terme).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Série vectorielle pFUSE	n/a	InvivoGen	Gènes d’anticorps lourds et légers exprimés dans des vecteurs distincts qui nécessitent une co-transfection.
Série vectorielle mAbXpress	n/a	ACYTE Biotech Pty Ltd.	Gènes d’anticorps lourds et légers exprimés dans des vecteurs distincts qui nécessitent une co-transfection. Renvoi : Jones, M. L. et al. Procédé de reformatage rapide, indépendant de la ligature, d’anticorps monoclonaux recombinants. J Méthodes immunitaires. 354 (1-2), 85-90, doi :10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
Vecteur pVITRO1	n/a	n/a	Les gènes des anticorps lourds et légers sont chacun pilotés par un promoteur distinct dans un seul vecteur. Voir : Dodev, T. S. et al. Une boîte à outils pour le clonage et l’expression rapides d’anticorps recombinants. Sci Rep. 4 5885, doi :10.1038/srep05885, (2014).
Série vectorielle GS	n/a	Lonza	Vecteur multi-cistronique avec des gènes d’anticorps lourds et légers co-exprimés et traduits en transcrit unique.
Vecteur multi-cistronic série 1	n/a	n/a	Vecteur multi-cistronique avec des gènes d’anticorps lourds et légers co-exprimés et traduits en transcrit unique. Référence : Li, J. et al. Une étude comparative de différents modèles de vecteurs pour l’expression chez les mammifères d’anticorps IgG recombinants. J Méthodes immunitaires. 318 (1-2), 113-124, doi :10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vectoriel série 2	n/a	n/a	Vecteur multi-cistronique avec des gènes d’anticorps lourds et légers co-exprimés et traduits en transcrit unique. Se référer à : Ho, S. C. et al. Vecteurs tricistroniques médiés par IRES pour améliorer la génération de lignées cellulaires CHO exprimant des anticorps monoclonaux élevés. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi :10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Référence 61883	Addgene	Vecteur d’expression de mammifère contenant des gènes d’anticorps anti-trastuzumab avec gène de résistance à l’hygromycine ; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ était un cadeau d’Andrew Beavil.
Gélose hygro Fast-Media	Fas-HG-S	Recherche sur Jomar Life	Utilisé pour préparer une gélose LB à faible teneur en sel contenant 75 μg/ml d’hygromycine.
Fast-Media Hygro TB	Fas-HG-L	Recherche sur Jomar Life	Utilisé pour préparer un bouillon de tuberculose à faible teneur en sel contenant 75 μg/ml d’hygromycine.
Glycérol, BioXtra, ≥99 %	Réf. G6279	Sigma-Aldrich	Préparer à 80 % avec de l’eau et de l’autoclave. Conserver à température ambiante.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	G221020	Astral Scientific	Kit de préparation Plasmid Maxi ; éluer ou remettre en suspension l’ADN dans l’eau (pH 7,0-8,5).
Cellules FreeStyle 293-F	Référence R790-07	Technologies de la vie	Lignée cellulaire HEK-293 adaptée à la culture en suspension en milieu sans sérum.
FreeStyle 293 Médium d’expression	Référence 12338-018	Technologies de la vie	Milieu sans sérum spécialement formulé pour maintenir la lignée cellulaire 293-F et l’expression élevée des protéines.
Kolliphor P188	K4894	Sigma-Aldrich	Tensioactif non ionique ; pluronique F-68 ; préparer à 10 % dans l’eau et filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Conserver à 4oC.
DMEM, hyperglycémie	Référence 11995-065	Technologies de la vie
Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur	Référence 10082-147	Technologies de la vie
Polyéthylénimine, linéaire, MW 25 000	Référence 23966	Polysciences, Inc.	Préparer à 1 mg/ml dans l’eau. Ajuster à un pH de 7,0 avec 1 M de HCl (la solution devient claire) et filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Conserver à -80°C jusqu’à utilisation.
OptiPro SFM	Référence 12309-050	Technologies de la vie	Milieu sans sérum formulé par transfection
Hygromycine B Solution	ANT-HG-1	Recherche sur Jomar Life
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	AJA2225	Thermo Fisher Scientific
Tryptone (caséine peptone)	LP0042B	Thermo Fisher Scientific	Préparer à 20 % de PBS et filtrer la stérilisation à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Conserver à 4oC.
Système BLItz	45 à 5000	fortéBIO	Instrument utilisé pour les mesures d’interférométrie de biocouche (BLI).