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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Isolement de cellules dendritiques dérivées de monocytes associées à la tumeur
- Dans une hotte à flux laminaire, retirez les tumeurs des souris euthanasiées au CO2 et placez les tumeurs dans un milieu RPMI sans sérum fœtal bovin (FBS).
note: Il est fortement recommandé de raser les souris et de les vaporiser avec de l’éthanol à 70 % avant d’enlever les tumeurs pour minimiser les contaminations potentielles de la fourrure. Assurez-vous que la tumeur ne dépasse pas 25 à 40mm2 car les tumeurs plus grandes ont moins de cellules dendritiques (DC) qui ont tendance à être fragiles et sujettes à la mort cellulaire. Si un plus grand nombre de DC est nécessaire, chaque souris peut être injectée avec des cellules tumorales à plusieurs endroits.
- Sous un capuchon laminaire stérile, coupez les tumeurs en petits morceaux (environ 1 x 1 mm2) à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Ajoutez tous les fragments tumoraux d'une souris dans un tube stérile à fond plat de 30 ml avec des barres d'agitation magnétiques contenant 5 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS), 2 mg/mL de collagénase IV et 0,01 mg/mL de DNase I.
prudence: Les cellules myéloïdes produisent de l’énergie par glycosylation, même à l’état stationnaire. Par conséquent, n'utilisez que des milieux contenant du glucose (par exemple, HBSS, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) et Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)), car une privation de glucose pendant aussi peu que 10 à 15 minutes entraînera la mort cellulaire et l'apoptose dans les 24 heures. N’utilisez qu’une collagénase IV à faible endotoxine, car la collagénase est produite par des bactéries à Gram positif (Clostridium histolyticum).
- Mélanger à environ 200 - 400 tr/min dans un incubateur à 37 °C avec un agitateur magnétique pendant 20 à 30 min.
- Ajouter 5 ml de média complet et remettre vigoureusement en suspension.
- Filtrez les cellules à travers une crépine de 70 μm. Centrifugeuse à 4 oC 400 rcf pendant 5 à 10 min pour granuler les cellules.
prudence: N’essayez pas d’isoler les cellules directement après la digestion enzymatique, car certaines tumeurs sont nécrotiques et contiennent des quantités relativement importantes de débris cellulaires ou de matrice extracellulaire. Appliquez les cellules sur un milieu à gradient de densité de 15 % pour obtenir uniquement les cellules.
- Suspendre 9 ml de milieu à gradient de densité avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 10x pour ajuster l’osmolalité et obtenir une solution mère 100 % Percoll. Mélangez une solution mère de milieu à gradient de densité de 1,5 mL avec 8,5 mL de HBSS et mélangez-la vigoureusement avec des pastilles de cellules dérivées de la tumeur. Superposer délicatement 2 mL de DMEM sur un milieu à gradient de densité de 15 % et centrifuger à 400 rcf pendant 20 min à température ambiante. Jetez les surnageants, car les cellules formeront une pastille au fond du tube.
- Lavez les cellules granulées deux fois en les mettant en suspension dans 10 ml de HBSS contenant 2 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine et 10 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (tampon d’isolement), puis centrifugez à 4 oC 400 rcf pendant 5 à 10 minutes pour granuler les cellules.
- Comptez les cellules sur un hémocytomètre à l’aide du bleu trypan au microscope optique.
- Remettre en suspension 1 x 108 cellules dans un tampon d’isolement de 1 mL et les incuber à 4 °C avec 30 μL de billes magnétiques conjuguées CD11b+ pendant 15 min.
ATTENTION : Évitez d’utiliser des billes conjuguées à CD11c, car cela activerait le DC et induirait la mort cellulaire. N’essayez pas de bloquer FcγRII et FcγRIII avec des anticorps anti-CD16/32. Les anticorps bloquants ligaturent FcγR, induisent une forte phosphorylation des protéines kinases activées par les mitogènes (MAP) et amorcent la DC.
- Enlever l’excès de billes non liées en ajoutant 9 mL de tampon d’isolement et des cellules de centrifugation à 400 rcf pendant 5 à 10 min à 4oC.
- Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un tampon d’isolement de 1 mL. Appliquez les cellules sur une colonne magnétique prélavée. Lavez la colonne deux fois avec 3 ml de tampon d’isolement.
- Retirez la colonne de l’aimant. Pipetez 6 ml de tampon d’isolement sur la colonne et rincez les cellules marquées magnétiquement dans un tube de prélèvement stérile en poussant le piston. Cellules de centrifugation à 400 rcf pendant 5 à 10 min à 4 oC.
- Remettre les cellules en suspension à 100 μL par 1 x 107 cellules et les colorer avec les anticorps conjugués aux fluorophores suivants : Linage négatif (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI et Ly6G), MHCII, Ly-6C.
- Triez les cellules en les bloquant par étapes, en utilisant la diffusion latérale (SSC) et la diffusion directe (FSC), et cultivez dans un milieu complet complété par 5 ng/mL DE GM-CSF – Incuber les cellules pendant 1 heure à 37 °C pour permettre aux macrophages d’adhérer à la plaque. Ensuite, transférez les cellules lâches et non adhérentes dans une nouvelle boîte de culture.
note: Les MoDC de souris sont définis comme CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int. L’expression de Ly6C peut varier considérablement entre les modèles tumoraux, et dans certains modèles (par exemple, LMP), les MoDC sont totalement dépourvus d’expression de Ly6C. Une tumeur de 100 mm3 B16F10 contient généralement 5 x 104 de DC, ce qui donne environ 4 à 5 x 106 cellules au total. Parmi ces cellules, 10 à 15 % sont des cellules immunitaires et 8 à 10 % sont des MoDC. L’augmentation du nombre de DC peut être obtenue en injectant des tumeurs à des souris à plusieurs endroits. Triez uniquement les petites cellules SSC/FCS, car d’autres cellules myéloïdes peuvent exprimer des marqueurs tels que CD11c et Ly6C.
optionnel: Triez le monocyte infiltrant la tumeur en petites cellules SSC/FSC qui expriment Ly6Chi et sont négatives pour MHCII. Par la suite, culture in vitro de monocytes avec 50 ng/mL DE GM-CSF pour obtenir des DC.
2. Préparation des complexes immuns IgG tumoraux
- Cultivez des cellules tumorales dans un flacon de culture de75 cm 2 jusqu’à une confluence de 70 % dans un milieu DMEM complet.
- Ajouter 2 mL de trypsine à 0,25 %/EDTA pour détacher les cellules du ballon de culture et surveiller la morphologie cellulaire au microscope optique pour éviter une surtrypsinisation.
- Ajouter 8 mL de milieu de culture complet (pour 2 mL de trypsine) pour inhiber la digestion de la trypsine, et centrifuger à 4 °C, 400 rcf pendant 5 à 10 min pour granuler les cellules.
note: Vérifiez les cellules tumorales pour les mycoplasmes à l’aide d’un kit PCR commercial. Testez les bactéries à Gram négatif et les endotoxines fongiques à l’aide du test Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Le sérum doit être filtré à 0,22 μM et testé pour les virus du 9 Code of Federal Regulations. De plus, testez les milieux de culture et les sérums en déposant 100 à 200 μL sur une gélose LB ou un bouillon et cultivez pendant 2 jours à 37 °C.
- Lavez à nouveau les cellules de la trypsine et des restes sériques en les mettant à nouveau en suspension dans 10 mL de PBS et en centrifugeant à 400 rcf pendant 5 à 10 min. Aspirez le surnageant et répétez le lavage 2 fois de plus.
- Fixez les cellules dans du paraformaldéhyde tamponné à 1,8 % pendant 10 min à température ambiante.
- Lavez les cellules en les remettant en suspension dans 10 mL de PBS et centrifugez-les à 4 oC 400 rcf pendant 5 à 10 min.
- Aspirez les surnageants et recommencez le lavage deux fois de plus.
optionnel: Pour les tests d’absorption tumorale, les cellules peuvent être marquées en les incubant pendant 5 minutes à 37 °C dans du PBS contenant 1 μM d’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE). Le CFSE est ensuite trempé avec un média complet pendant 10 min dans de la glace. Les cellules doivent être soigneusement lavées dans du PBS contenant 2 % de sérum pour éliminer le colorant résiduel.
- Remettre les cellules en suspension dans un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (PBS complété par 2 % de FCS + 5 mM d’EDTA) et 0,5 μg/mL d’anti-CD16/32 pour bloquer les interactions protéine-protéine non spécifiques potentielles. Plaque en forme de U 96 puits/plaque à une concentration de 1 x 105 cellules par 100 μL.
- Ajoutez différentes dilutions d’anticorps de liaison à la tumeur allant de 5 μg à 5 ng/1 x 105 cellules. Incuber la plaque sur de la glace pendant 15-20 min.
note: Des anticorps IgG ont été isolés dans le sérum de souris femelles naïves âgées de 20 à 24 semaines sur des colonnes de protéine A, comme décrit.
- Laver les cellules en ajoutant 150 μL de PBS et en centrifugeant la plaque à 4 oC 400 rcf pendant 5 à 10 min.
- Jetez les surnageants et répétez le lavage deux fois. Remettre les cellules en suspension dans un tampon FACS de 100 μL contenant des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores. Incuber l’assiette sur de la glace pendant 20 min.
- Lavez les cellules en ajoutant 200 μL de tampon FACS et en centrifugeant la plaque à 400 rcf pendant 5 à 10 min. Jetez les surnageants et répétez le lavage.
- Analysez la liaison tumorale par cytométrie en flux et déterminez la concentration minimale requise pour enrober les cellules.
note: Les anticorps qui n’augmentent pas l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) des cellules tumorales colorées d’au moins cinq fois par rapport au contrôle des isotypes ne doivent pas être utilisés dans les tests fonctionnels ultérieurs.
3. Activation de MoDC avec Tumor-IgG IC
- Envelopper les cellules tumorales avec une concentration minimale d’IgG, comme décrit dans les sections 2.1 à 2.4.3
- Un jour avant d’activer le MoDC avec le CI tumoral, remplacez le milieu de culture MoDC contenant du GM-CSF. Pour ce faire, aspirez doucement le milieu et lavez une fois les cellules avec un milieu de culture complet préchauffé.
note: Les MoDC matures isolées associées à une tumeur doivent être cultivées pendant au moins 2 à 3 h (ou même toute la nuit) après triage dans un milieu complet sans GM-CSF, et avant de les activer avec IC.
- Pour les analyses d’absorption tumorale, ajoutez le CI tumoral marqué CFSE au MoDC dans un rapport de 1:5 (IC : MoDC) et incubez pendant une nuit de 12 à 16 h dans 1 mL de milieu complet par 1 x 106 DC.
- Pour les analyses FACS des expériences d’activation de MoDC, ajoutez tumor-IC à un rapport de 1:1 (IC : MoDC) et incubez pendant une nuit pendant 12 à 16 h
note: Il est fortement recommandé d’inclure un puits de contrôle positif, dans lequel les MoDC sont stimulés avec 1 μg/mL de LPS ou d’autres agonistes du TLR.
- Après l’activation pendant la nuit, aspirer les surnageants et laver doucement les cellules trois fois avec un tampon d’isolement ou 10 mM D’EDTA HBSS.
- Pour détacher le DC de la plaque, incubez des cellules pendant 2 à 3 minutes dans 1 mL de HBSS contenant 10 mM d’EDTA et détachez les cellules par un pipetage vigoureux.
- Centrifuger les cellules à 400 rcf et remettre en suspension 1 x 106 DC dans 90 μL de PBS complété par 2 % de FCS, 5 mM d’EDTA (tampon FACS) et 0,5 μg d’anticorps bloquants. Incuber sur glace pendant 5 à 10 min.
- Ajouter 10 μL de mélange d’anticorps colorants aux cellules et incuber sur de la glace pendant 15 min.
- Ajouter 2 mL de tampon FACS dans les cellules et centrifuger à 4 oC 400 rcf pendant 5 à 10 min.
- Remettre les cellules en suspension dans un tampon FACS de 200 μL.
- Ajouter 0,5 à 1 μg/mL de DAPI 1 à 2 min avant de prélever les échantillons pour exclure les cellules mortes des analyses. Ne surincubez pas le DAPI, car le MoDC le prendra dans les 10 à 15 minutes.