Mesure de l’efficacité phagocytaire des macrophages avec la primaquine et la thérapie photodynamique

Résumé

La vidéo démontre l'évaluation de l'impact du traitement photodynamique sur l'efficacité phagocytaire des macrophages murins avec la primaquine. Traités, les macrophages infectés génèrent des espèces réactives de l’oxygène, entraînant une mort fongique sélective, évidente par une réduction des colonies sur la plaque.

Protocole

1. Préparation des cellules cryptococciques

1. Étaler l’organisme d’essai à l’aide d’une boucle d’inoculation sur une plaque de gélose stérile à base d’extrait de levure et de malt (YM).
2. Incuber la plaque de gélose à 30°C pendant 48 h.
3. À l’aide d’une boucle d’inoculation, prélevez 5 colonies simples et suspendez-les dans 5 mL d’eau distillée stérile.
4. Normaliser les cellules à l’aide d’un étalon McFarland pour obtenir une concentration cellulaire comprise entre 0,5 × 10⁵ et 2,5 × 10⁵ unités formant colonies (UFC) par mL de milieu RPMI-1640.
5. Versez une suspension cellulaire de 100 μL dans des puits de plaques de microtitration contenant des macrophages ensemencés (voir la section ci-dessous).

2. Préparation des macrophages

1. Cultiver une lignée cellulaire de macrophages murins, RAW 264.7, sur une fiole contenant 10 mL de milieu RPMI-1640, complétée par 20 mg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 20 U/mL de pénicilline et 10 % de sérum de bovin fœtal.
2. Placez le ballon dans un incubateur à 5 % de CO₂ réglé à 37 °C jusqu’à ce que la confluence atteigne 80 %.
3. Grattez doucement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire.
4. Transférez les cellules suspendues dans un tube à centrifuger de 15 ml.
5. Utilisez la coloration au bleu trypan pour déterminer la viabilité cellulaire.
   note: Un score de viabilité supérieur à 85 % est préférable.
6. À l’aide d’un hémocytomètre, ajustez la concentration cellulaire des macrophages à 1 × 10^{à 6} cellules/mL à l’aide d’une solution de 10 mL de milieu RPMI-1640 frais et stérile.
7. Distribuer une suspension de 100 μL de cellules dans les puits d’une plaque de microtitration stérile à fond plat de 96 puits.
8. Incuber la plaque pendant une nuit dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37°C.
   note: Avant utilisation, le milieu usé pendant la nuit doit être aspiré et remplacé par 100 μL de milieu frais et stérile Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640).

3. Préparation du composé

1. Dissoudre les photosensibilisants d’essai et la primaquine (PQ) dans de l’eau distillée pour préparer une solution mère.
2. Diluez davantage le composé dans le média RPMI-1640.
   note: La quantité finale d’eau distillée dans le milieu RPMI-1640 ne doit jamais dépasser 1 %.
3. Distribuer une solution de 100 μL du photosensibilisant préparé pour quadrupler la concentration souhaitée dans des puits appropriés contenant les macrophages et les cellules cryptococciques déjà ensemencés.

4. Mise en œuvre du traitement photodynamique (PDT)

1. Mettre en place les conditions expérimentales suivantes :
   1. Cellules co-cultivées avec 0 μM de PQ et exposées à la lumière sombre (DL) pendant 2 min (c.-à-d. cellules non traitées (non Rx))
   2. Cellules co-cultivées avec 6 μM et exposées à DL pendant 2 min (c’est-à-dire effet médicamenteux)
   3. Cellules co-cultivées à 15 μM de PQ et exposées à DL pendant 2 min (c.-à-d. effet du médicament)
   4. Cellules co-cultivées avec 30 μM de PQ et exposées à DL pendant 2 min (c.-à-d. effet médicamenteux)
   5. Cellules co-cultivées avec 0 μM de PQ et exposées aux ultraviolets (UV) pendant 2 min (effet UV)
   6. Cellules co-cultivées avec 6 μM de PQ et exposées à la lumière ultraviolette (UVL) pendant 2 min (c’est-à-dire effet PDT)
   7. Cellules co-cultivées avec 15 μM de PQ et exposées à l’UVL pendant 2 min (c.-à-d. effet PDT)
   8. Cellules co-cultivées avec 30 μM de PQ et exposées à l’UVL pendant 2 min (c’est-à-dire effet PDT)
      note: Les cellules co-cultivées doivent réagir avec la PQ pendant 30 minutes dans l’obscurité (le cas échéant), avant d’être exposées à l’UVL (le cas échéant).
      note: Dans les travaux actuels, nous avons déterminé que le PQ a une absorption UV/Vis de 260 nm, ce qui se situe dans la gamme UV de la lampe germicide. Pour cette raison, nous avons utilisé une lampe germicide ultraviolette C (UVC) installée dans une enceinte de sécurité biologique de classe II comme source de lumière pour mettre en œuvre la PDT. La lampe aurait une puissance nominale de 30 watts. Dans l’étude actuelle, les cellules ont été maintenues à environ 20 cm de la lampe. À cette distance, on estime que la lampe a une puissance de rayonnement de 625 μW/cm².

5. Compter les colonies pour déterminer la survie des cellules cryptococciques

1. Après avoir initié le traitement photodynamique des cellules co-cultivées comme indiqué ci-dessus, incuber les plaques à 37°C dans 5 % de CO₂ pendant 18 h.
2. Après 18 h, aspirez le surnageant.
3. Lavez les puits avec 200 μL de solution tampon de phosphate (PBS) pour éliminer les cellules non internalisées. Répétez cette étape trois fois.
4. Ajouter 300 μL de Triton X-100 à 0,1 % dans les puits et incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
5. Aspirez le contenu des puits et distribuez-le dans des tubes en plastique stériles de 1,5 ml.
6. Préparez une dilution de 1 sur 10 des cellules avec de l’eau distillée.
   note: Ajustez la dilution de manière à ce qu’il soit possible de récupérer entre 30 et 300 colonies sur des plaques de gélose.
7. Pipeter 50 μL de la dilution sur une plaque gélosée de malt de levure (YM).
8. Utilisez une méthode de plaque étalée pour créer une pelouse de confluence de cellules à la surface de la plaque de gélose.
9. Incuber les plaques à 30°°C pendant 48 h.
10. Compter les unités formant colonies (UFC) développées sur les plaques de gélose.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
agar-agar	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
Extrait de levure	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
Extrait de malt	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
Peptone	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
glucose	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
Tache bleue trypan	Sigma-Aldrich		Pour dénombrer les cellules vivantes et mortes
Norme McFarland	Fisher Scientific		Pour standardiser les cellules
Primaquine	Merck		Utilisé comme photosensibilisant
Solution tampon de phosphate (PBS)	Sigma-Aldrich		Laver et diluer les cellules
RPMI- 1640 moyen	Biochrom		Milieux de culture pour les macrophages
Sérum fœtal bovin (FBS)	Biochrom		Utilisé en complément du support RPMI-1640
Pénicilline/Streptomycine/L-glutamine	Sigma-Aldrich		Ajouté au support RPMI-1640
0,1 % Triton X-100	Sigma-Aldrich		Utilisé pour lyser les macrophages
Plaque de microtitration à fond plat de 96 puits	Greiner Bio-One		Utilisé comme récipient à l’intérieur duquel les réactions étaient transportées
Fiole en tissu	Lasec		Utilisé pour cultiver des macrophages
Tube à centrifuger de 50 mL	Lasec		Utilisé pour contenir des macrophages
Racleur de cellules	Lasec		Utilisé pour détacher les macrophages de la fiole tissulaire
Boucle d’inoculation	Lasec		Utilisé pour strier la culture sur la plaque de gélose
Hémocytomètre	Marienfield		Déterminer la concentration cellulaire des macrophages
Tubes en plastique de 1,5 mL	Merck		Utilisé comme récipient à l’intérieur duquel les réactions étaient transportées
UVL	ESCO		Utilisé pour l’activation du photosensibilisateur
Incubateur à CO2	ThermoFisher		Utilisé pour incuber les macrophages
Enceinte de sécurité biologique de classe II	ESCO		Travailler en toute sécurité avec les agents pathogènes sans nuire à l’utilisateur.