L’effet de l’aspirine et de l’ibuprofène sur la capacité phagocytaire des macrophages

Résumé

Cette vidéo présente une méthode permettant d’évaluer l’impact de l’aspirine et de l’ibuprofène, à leurs concentrations minimales inhibitrices, sur la phagocytose des macrophages à l’aide de cellules fongiques sensibles au pH fluorescent et colorées par un colorant. Les médicaments inhibent la cyclooxygénase-2, diminuant la formation de prostaglandines et stimulant la phagocytose des macrophages, comme observé par des mesures de fluorescence de colorants sensibles au pH.

Protocole

1. Considérations de sécurité

1. Le personnel doit porter un équipement de protection individuelle (EPI).
2. Manipulez l’agent pathogène et les macrophages dans une enceinte de sécurité biologique de classe II.

2. Préparation des macrophages

1. Cultiver une lignée cellulaire de macrophages murins, RAW 264.7, dans une fiole tissulaire contenant 10 mL de milieu Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), complété par 20 mg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 20 U/mL de pénicilline et 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS).
2. Placez le ballon dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone (CO₂) réglé à 37 °C jusqu’à ce que la confluence atteigne 80 %.
3. Grattez doucement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire.
4. Transférez les cellules suspendues dans un tube à centrifuger de 15 ml.
5. Utilisez la coloration au bleu trypan pour déterminer la viabilité cellulaire.
   note: Un score de viabilité supérieur à 85 % est préférable.
   À l’aide d’un hémocytomètre, ajuster la concentration cellulaire des macrophages à 1 × 10^{à 5} cellules/mL à l’aide d’une solution de 10 mL de milieu RPMI-1640 frais et stérile. Distribuer une suspension de 100 μL de cellules dans les puits d’une plaque de microtitration stérile à fond plat de 96 puits. Incuber la plaque pendant une nuit dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37°C.
   note: Le milieu épuisé pendant la nuit doit être aspiré et remplacé par 100 μL de milieu RPMI-1640 frais et stérile avant utilisation.

3. Préparation des cellules cryptococciques

1. Étaler l’organisme d’essai à l’aide d’une boucle d’inoculation sur une plaque de gélose stérile à base d’extrait de levure et de malt (YM).
2. Incuber la plaque de gélose à 30°C pendant 48 h.
3. À l’aide d’une boucle d’inoculation, inoculez une boucle de cellules dans 100 mL de bouillon de base d’azote de levure (YNB) complété par 4 % de glucose.
4. Cultiver les cellules (pré-culture) pendant la nuit en agitant à 160 tr/min à 30°C.
5. Le lendemain, inoculer 0,1 mL de la pré-culture dans du bouillon YNB frais (culture principale) et laisser les cellules se développer jusqu’à la phase mi-exponentielle (dans les mêmes conditions de culture).
6. Lavez les cellules deux fois avec une solution tampon de phosphate (PBS).
7. À l’aide d’un hémocytomètre, normaliser les cellules à 1 x 10⁵ dans le PBS.

4. Coloration des cellules cryptocoques avec la coloration de phagocytose

1. Distribuez 999 μL des cellules dans un tube en plastique de 1,5 ml.
2. Ajouter 1 μL de colorant vert pHrodo zymosan A dans le même tube.
3. Incuber les cellules à température ambiante pendant 1 h, dans l’obscurité, avec une agitation lente pour réagir avec la tache.
4. À la fin de la période d’incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS.
5. Distribuer une suspension cellulaire de 100 μL dans des puits contenant des macrophages ensemencés.

5. Préparation des médicaments

1. Préparez une solution mère d’aspirine en utilisant 1 mg d’aspirine dans 1000 ml d’éthanol absolu jusqu’à une concentration finale de 1000 μg/mL.
2. Diluez davantage le composé dans le milieu RPMI-1640 pour atteindre les concentrations de médicament souhaitées.
   note: La quantité finale d’éthanol dans le milieu RPMI-1640 ne doit jamais dépasser 1 %. Préparez une solution mère d’ibuprofène en utilisant 1 mg d’ibuprofène dans 1000 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluez davantage le composé dans le milieu RPMI-1640 pour atteindre les concentrations de médicament souhaitées.
   note: La quantité finale de DMSO dans les supports RPMI-1640 ne doit jamais dépasser 1 %. Préparez une solution de 100 μL des médicaments préparés à quatre fois les concentrations souhaitées et distribuez-la dans des puits appropriés contenant des macrophages ensemencés et des cellules cryptococciques.

6. L’effet des agents chimio-sensibilisants sur la phagocytose des macrophages

1. Incuber les plaques avec des cellules co-cultivées en présence d’agents chimio-sensibilisants, d’aspirine ou d’ibuprofène dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 2 h ou 6 h.
2. A la fin de la période d’incubation, mesurer la fluorescence induite (ex : 492 nm et em : 538 nm).
   note: La coloration pHrodo n’est fluorescente que dans les environnements acides, comme à l’intérieur du phagosome.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
agar-agar	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
Extrait de levure	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
Extrait de malt	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
Peptone	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
Base d’azote de levure (YNB)	Laboratoires Difco		Utilisé dans la culture de cellules cryptococciques
glucose	Merck		Utilisé pour préparer les plaques YM
Tache bleue trypan	Sigma-Aldrich		Pour dénombrer les cellules vivantes et mortes
Solution tampon de phosphate (PBS)	Sigma-Aldrich		Laver et diluer les cellules
RPMI- 1640 moyen	Biochrom		Milieux de culture pour les macrophages
Sérum fœtal bovin (FBS)	Biochrom		Utilisé en complément du support RPMI-1640
Pénicilline/Streptomycine/L-glutamine	Sigma-Aldrich		Ajouté au support RPMI-1640
Coloration pHrodo green zymosan A	Technologies de la vie		Utilisé pour colorer les cellules internalisées en raison d’un changement de pH
Acide acétylsalicylique (aspirine)	Sigma-Aldrich		Le médicament à tester
Éthanol absolu	Merk		Utilisé pour dissoudre l’aspirine
ibuprofène	Sigma-Aldrich		Médicament à tester
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Merk		Utilisé pour dissoudre l’ibuprofène
Plaques de microtitration à fond plat à 96 puits	Greiner Bio-One		Utilisé comme récipient à l’intérieur duquel les réactions étaient transportées
Fiole en tissu	Lasec		Utilisé pour cultiver des macrophages
Tube à centrifuger de 15 mL	Lasec		Utilisé pour contenir des macrophages
Racleur de cellules	Lasec		Utilisé pour détacher les macrophages de la fiole tissulaire
Boucle d’inoculation	Lasec		Utilisé pour strier la culture sur la plaque de gélose
Hémocytomètre	Marienfield		Déterminer la concentration cellulaire des macrophages
Tubes en plastique de 1,5 mL	Merck		Utilisé comme récipient à l’intérieur duquel les réactions étaient transportées
Spectrophotomètre de recherche EZ Read 800	Biochrom		Pour lire la densité optique
Fluoroskan Ascent FL	Thermo-Scientifique		Pour mesurer la fluorescence
Incubateur de CO2	Thermo-Fisher		Utilisé pour incuber les macrophages
Enceinte de sécurité biologique de classe II	ESCO		Travailler en toute sécurité avec les agents pathogènes sans nuire à l’utilisateur.