Méthode d’immunofluorescence pour mesurer la neutralisation d’un cytomégalovirus humain

Résumé

Cette vidéo présente un test d’immunofluorescence conçu pour mesurer la neutralisation du cytomégalovirus humain (HCMV). Les anticorps spécifiques du virus sont mélangés au virus et incubés avec des cellules de fibroblastes humains. Les anticorps neutralisent le virus, ce qui le rend incapable d’infecter les cellules hôtes, tandis que les virus non neutralisés infectent les cellules. Après l’incubation, l’étendue de la neutralisation est déterminée en quantifiant les cellules infectées par le virus à l’aide de l’immunofluorescence.

Protocole

1. Préparation des cellules cibles pour l’infection

1. Implantez des cellules cibles la veille de la réalisation de l'expérience dans une plaque à 96 puits (la plaque « cible »).
2. Plaquez suffisamment de cellules par puits pour assurer une monocouche presque confluente (~90 %).
   note: Cela dépendra de la taille relative de votre type de cellule cible. Si vous utilisez des fibroblastes de prépuce humain (HFF), ensemencez 20 000 cellules/puits.
3. En règle générale, 21 puits (7 en aval sur 3 de diamètre) doivent être ensemencés par échantillon, ce qui permet d’analyser 4 échantillons par plaque.
4. Ensemencer 12 puits supplémentaires par plaque (c.-à-d. rangée 8) pour servir de témoins.

2. Préparation du virus : mélanges d’anticorps

1. Ajouter 90 μL de milieu combiné à des anticorps (et bien mélangé) pour créer deux fois la concentration initiale souhaitée d'anticorps lors de l'essai dans 3 puits de la rangée 1 d'une plaque fraîche à 96 puits (la plaque de « dilution »).
   note: Une concentration initiale typique d’anticorps serait de 20 μg/mL, mais devrait être déterminée empiriquement.
2. Ajoutez 60 μL de média dans chacun des 18 puits situés en dessous (c.-à-d. 6 vers le bas par 3 en travers) des 3 puits de l’étape 2.1.
3. Ajouter 60 μL de milieu dans 12 puits supplémentaires (c.-à-d. rangée 8).
4. Transférez 30 μL de dilution d’anticorps de la rangée 1 vers les puits correspondants de la rangée 2.
5. Mélangez le contenu de la rangée 2 en pipetant doucement de haut en bas 20 fois avec la pipette multicanaux.
6. Transférez 30 μL de dilution d’anticorps de la rangée 2 à la rangée 3.
7. Répétez ce processus de mélange et de transfert jusqu’à ce que le contenu de la rangée 7 ait été mélangé.
8. Une fois que la rangée 7 a été mélangée, jetez 30 μL des puits de la rangée 7.
9. Diluer le HCMV dans un milieu complet de sorte que 50 μL contiennent suffisamment de particules infectieuses pour entraîner une infection MOI=1 si elles sont ajoutées directement aux cellules.
   note: Le HCMV est un agent pathogène de catégorie de biosécurité de niveau 2 (BSL-2). Assurez-vous que des procédures de sécurité appropriées sont en place et utilisez des filtres pour tous les médias exposés au HCMV.
   note: Cela nécessite le même nombre de particules infectieuses qu’il y a de cellules/puits, qui variera en fonction du type de cellule et du tropisme du virus. Si vous utilisez des HFF comme décrit ci-dessus, la concentration virale requise est de 4 x 10⁵ pfu/mL.
   note: S’assurer qu’un excès suffisant de virus dilué (p. ex., 10 % supplémentaire) est préparé.
10. Ajouter 60 μL de virus dilué dans tous les puits contenant des dilutions d’anticorps et dans 6 puits contenant seulement 60 μL de milieu.
11. Ajouter 60 μL de milieu seulement dans les 6 puits restants de milieu seulement, pour servir de témoins non infectés.
12. Incuber le virus obtenu : mélanges d’anticorps à 37^°C pendant 1 h.

3. Infection des cellules cibles

1. Retirez tous les supports des cellules cibles.
2. À l'aide d'une pipette multicanaux, transférez 100 μL de mélange virus :anticorps de la plaque de « dilution » sur les cellules en position équivalente sur la plaque « cible ».
3. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 24 h.

4. Fixation des cellules

1. Retirez tous les supports de cells.
   note: Il n’est pas nécessaire de changer les pointes entre les puits à ce stade.
2. Lavez tous les puits avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 200 μL et retirez-les.
3. Ajouter 180 μL -20 ^oC, 100 % d’éthanol dans tous les puits.
4. Incuber la plaque à -20 ^°C pendant au moins 30 min
   note: Cette étape peut être prolongée jusqu’à au moins un mois, à condition d’ajouter de l’éthanol supplémentaire lorsqu’il commence à s’évaporer.
   note: À partir de ce moment, la plaque peut être manipulée en toute sécurité dans des conditions BSL-1, et des pointes non filtrantes peuvent être utilisées.

5. Détection des cellules infectées par immunofluorescence (IF)

1. Retirez l’éthanol de la plaque.
2. Lavez tous les puits avec 200 μL de PBS et retirez-les.
3. Ajouter 200 μL de PBS dans tous les puits et incuber pendant 5 min.
   1. Pendant ce temps, préparez la dilution des anticorps primaires dans le PBS.
   2. 100 μL d’anticorps monoclonaux anti-IE de souris 1:2000 seront nécessaires par puits (notez que la dilution concerne l’anticorps spécifique indiqué dans les matériaux).
      REMARQUE : La dilution de l’anticorps utilisé pour la FI peut nécessiter une optimisation si une alternative est utilisée.
   3. Mélange vortex pour assurer un mélange suffisant.
4. Retirer le PBS de tous les puits et ajouter 100 μL de dilution d’anticorps primaires.
5. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
6. Retirer l’anticorps primaire de tous les puits.
7. Ajouter 200 μL de PBS et incuber pendant 5 min.
   1. Pendant ce temps, préparez l’anticorps secondaire et la dilution du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans le PBS.
   2. 100 μL d’IgG anti-souris conjuguées au fluorophore 1:2000 et 1 μg/mL de DAPI seront nécessaires par puits.
   3. REMARQUE : La dilution de l’anticorps secondaire utilisé pour la FI peut nécessiter une optimisation si une alternative est utilisée.
   4. Mélange vortex pour assurer un mélange suffisant.
8. Retirer le PBS de tous les puits et ajouter 100 μL de dilution secondaire d’anticorps/DAPI.
9. Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 h, à l’abri de la lumière.
10. Retirer les anticorps secondaires/DAPI de tous les puits.
11. Lavez tous les puits avec 200 μL de PBS et retirez-les.
12. Ajouter 200 μL de PBS dans tous les puits et incuber pendant 5 min.
13. Retirez le PBS et ajoutez 100 μL de PBS dans tous les puits et stockez-le, à l’abri de la lumière, à 4 ^oC jusqu’au moment de prendre l’image.
    note: Les plaques peuvent être stockées jusqu’à un mois avec une perte minimale de qualité du signal et de l’image.

6. Imagerie et comptage des cellules infectées

1. Pour quantifier l’infection facilement et avec précision, imagez au moins 25 % de chaque puits, à la fois dans les canaux bleu (DAPI, noyaux) et anticorps secondaires (HCMV immediate-early proteins (IE).
   note: Le signal généré par l’immunofluorescence IE doit ressembler à celui de la coloration nucléaire et les images doivent être vérifiées pour le confirmer.
2. Cela peut être effectué manuellement, mais l’utilisation d’un microscope automatisé est conseillée.
   note: Le grossissement dépendra de votre instrument, mais comme de grandes structures (noyaux) sont imagées, des objectifs 4X/10X sont généralement suffisants.
3. Une fois les images acquises, traitez-les à l’aide du programme d’analyse logicielle de votre choix.
   1. Tout d’abord, identifiez les noyaux via le canal bleu, pour calculer le nombre de cellules présentes.
   2. Seules ces zones doivent ensuite être vérifiées pour le signal dans le canal rouge, car IE est une protéine localisée nucléaire, pour calculer le nombre de cellules infectées.
4. Une fois que le nombre de cellules infectées et le nombre total de cellules sont calculés, calculez le pourcentage d’infection par puits.
5. Ces valeurs peuvent être corrigées pour tenir compte des niveaux de détection de fond en soustrayant le pourcentage moyen d’infection observé dans les puits non infectés de tous les autres puits.
   note: Ce chiffre devrait être bien inférieur à 1 %. S’il est supérieur à 1 %, la procédure d’analyse nécessite une optimisation.
6. Ces valeurs corrigées de l’arrière-plan peuvent désormais être tracées, interrogées et analysées à volonté.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Clone d’anticorps monoclonal anti-IE de souris 6F8.2	Millipore	MAB8131	Anticorps primaire pour l’immunofluorescence
IgG anti-souris de lapin, anticorps conjugué Alexa fluor 568	Invitrogen	A-11061	Anticorps secondaire pour l’immunofluorescence
Système d’imagerie à haut contenu WiScan® Hermes	Idée Bio-médicale	-	Microscope fluorescent automatisé à haut débit pour la quantification
Logiciel d’analyse d’images Metamorph	Dispositifs moléculaires	-	Logiciel d’analyse d’images
Contrôle de l’isotype IgG1 humain	Merck	Référence M5284	Anticorps de contrôle pour la neutralisation
8F9, anticorps anti-HCMV glycoprotéine B	-	-	Anticorps neutralisant contre le HCMV
DAPI	Thermo Scientific	Référence 62248	Coloration des noyaux cellulaires
DMI4000B Microscope à fluorescence inversée	Leica	-	Microscope fluorescent utilisé pour des images représentatives