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1. Couplage covalent des anticorps de capture aux microsphères MagPlex
Chaque anticorps de capture est conjugué à un ensemble spécifique de microsphères magnétiques carboxylées à l’aide d’une procédure en deux étapes comme décrit ci-dessous.
REMARQUE : Un kit de couplage comprenant tous les réactifs, tampons et matériaux nécessaires au couplage de microsphères est également disponible (voir TABLEAU DES MATÉRIAUX).
- Remettez en suspension la suspension de microsphère découplée d’origine selon les instructions décrites dans la fiche d’information du produit fournie avec vos microsphères.
note: Les instructions de remise en suspension dépendront de la taille et du volume de vos flacons de microsphères en stock.
- Transférez 2,5 x 106 des microsphères mères dans un tube de microcentrifugation recommandé (voir TABLEAU DES MATÉRIAUX).
- Placez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 secondes.
- Avec le tube toujours positionné dans le séparateur magnétique, retirez le surnageant.
note: Veillez à ne pas déranger les microsphères.
- Retirer le tube du séparateur magnétique et remettre en suspension les microsphères dans 100 μL dedH2O par vortex et sonication pendant 20 secondes.
- Répétez les étapes 3 et 4.
- Retirer le tube du séparateur magnétique et remettre en suspension les microsphères lavées de 80 μL de phosphate de sodium monobasique de 0,1 M, pH 6,2 par vortex et sonication pendant 20 secondes.
- Ajouter 10 μL de N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) (dilué dans 0,1 M de phosphate de sodium monobasique, pH 6,2) dans les microsphères et mélanger doucement par vortex.
- Ajouter 10 μL de chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl]carbodiimide (EDC) (dilué dans 0,1 M de phosphate monobasique de sodium, pH 6,2) à 50 mg/mL et mélanger doucement par vortex.
- Incuber pendant 20 minutes à température ambiante avec un mélange doux par vortex à intervalles de 10 minutes.
- Placez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 secondes.
- Avec le tube toujours positionné dans le séparateur magnétique, retirez le surnageant.
note: Veillez à ne pas déranger les microsphères.
- Retirer le tube du séparateur magnétique et remettre les microsphères en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 250 μL, pH 7,4 par vortex et sonication pendant environ 20 secondes.
- Placez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 secondes.
- Avec le tube toujours positionné dans le séparateur magnétique, retirez le surnageant.
note: Veillez à ne pas déranger les microsphères.
- Répétez les étapes 13 à 15 pour un total de deux lavages.
- Retirer le tube du séparateur magnétique et remettre en suspension les microsphères activées et lavées dans 100 μL de PBS, pH 7,4 par vortex et sonication pendant environ 20 secondes.
- Ajouter 12,5 μg d’anticorps de capture aux microsphères remises en suspension (c.-à-d. 5 μg/1 million de microsphères).
note: Les anticorps monoclonaux sont préférés pour la capture, mais des anticorps polyclonaux peuvent également être utilisés.
REMARQUE : 5 μg de protéines pour 1 million de billes donnent généralement de bons résultats, mais nous recommandons de titrer la quantité pour obtenir des performances de dosage optimales.
- Porter le volume total à 500 μL avec du PBS, pH 7,4.
- Réaction de couplage mixte par un vortex.
- Incuber pendant 2 heures avec mélange par rotation à température ambiante dans l’obscurité.
- Placez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 secondes.
- Avec le tube toujours positionné dans le séparateur magnétique, retirez le surnageant.
note: Veillez à ne pas déranger les microsphères.
- Retirer le tube du séparateur magnétique et remettre en suspension les microsphères couplées dans 1 ml de PBS, pH 7,4 contenant 0,02 % de Tween-20, 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,05 % d’azoture de sodium (PBS-TBN) par vortex et sonication pendant 20 secondes.
- Placez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 secondes.
- Avec le tube toujours positionné dans le séparateur magnétique, retirez le surnageant.
note: Veillez à ne pas déranger les microsphères.
- Répétez les étapes 24 à 26 pour un total de deux lavages.
- Retirez le tube du séparateur magnétique et mettez en suspension les microsphères couplées dans 500 μL de PBS-TBN.
note: Déterminez le nombre de microsphères récupérées à l’aide d’un compteur de cellules ou d’un hémocytomètre.
- Conservez les microsphères couplées au réfrigérateur entre 2 et 8 °C dans l’obscurité.
note: Un protocole permettant de confirmer l’efficacité du couplage est également disponible.
2. Marquage à la biotine des anticorps de détection
- Les anticorps de détection ont été marqués à la biotine à l'aide d'hexanoate de sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido) EZ-Link conformément aux instructions du fabricant, avec un excès molaire de réactif de biotine de 20 fois supérieur pour obtenir 4 à 6 groupes biotine par molécule d'anticorps><.
note: Les anticorps polyclonaux sont généralement utilisés pour la détection, mais les anticorps monoclonaux peuvent également être utilisés s’ils sont spécifiques pour un épitope différent de l’anticorps de capture.
note: Des anticorps biotinylés disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés pour la détection.
3. Détection d’organismes par immunodosage sandwich de capture multiplexée
Les ensembles de microsphères couplées et les anticorps de détection marqués générés en 1 et 2 ci-dessus sont utilisés dans un immunoessai sandwich de capture multiplexé pour détecter et quantifier les bactéries présentes dans un échantillon. La figure 1 présente une vue d’ensemble du flux de travail du test.
- Sélectionnez les flacons de stock de jeux de billes MagPlex couplés aux anticorps dans un stockage de 2 à 8 °C.
- Vortex et sonicate pendant 20 secondes.
- Préparez un mélange de billes multiplexées fonctionnel de sorte que chaque ensemble de billes ait une concentration finale de 2500 microsphères par 50 μL pour chaque puits de réaction (50 000 billes/ensemble/ml) dans PBS-TBN.
note: À l’aide d’un tabeur, déterminez les paramètres de préparation du mélange de billes de travail.
note: Des billes de contrôle interne (microsphères de moniteur RP1) peuvent également être incluses pour surveiller les performances du test et de l’instrument.
- Pipeter 50 μL de mélange de billes de travail dans les puits appropriés d’une plaque à 96 puits.
- Pipeter 50 μL d’étalon ou d’échantillon vers les puits appropriés.
- Pipeter 50 μL de PBS-TBN dans chaque puits de fond.
- Couvrez la plaque d’un joint en aluminium pour protéger les perles de la lumière et incubez sur un agitateur à plaque à température ambiante pendant 1 heure en secouant à 800 tr/min.
- Placez la plaque sur un séparateur de plaques magnétique pendant 1 minute.
- En gardant la plaque sur le séparateur de plaques magnétique, retirez soigneusement la feuille et retournez la plaque pour vider les puits, puis tapotez pour sécher sur une épaisse couche d’essuie-tout de laboratoire 3 à 4 fois.
note: Vous pouvez également aspirer manuellement les puits à l’aide d’une pipette multicanaux ou utiliser un laveur de plaques automatisé.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 200 μL de PBS-TBN dans chaque puits et agitez pendant 1 minute sur un agitateur à plaques à 800 tr/min.
- Placez la plaque sur un séparateur de plaques magnétique pendant 1 minute.
- En gardant la plaque sur le séparateur de plaques magnétiques, retournez la plaque pour vider les puits, puis tapotez pour sécher sur une épaisse couche d’essuie-tout de laboratoire 3-4 fois.
note: Vous pouvez également aspirer manuellement les puits à l’aide d’une pipette multicanaux ou utiliser un laveur de plaques automatisé.
- Répétez les étapes 10 à 12 pour un total de deux lavages.
note: Retirez autant de tampon que possible avant de passer à l’étape suivante pour éviter une dilution potentielle de la réaction.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 50 μL de tampon de dosage dans chaque puits et agitez pendant 1 minute sur un agitateur à plaque à 800 tr/min.
- Diluer l’anticorps de détection biotinylé à 4 μg/ml dans du PBS-TBN.
- Ajouter 50 μL de l’anticorps de détection dilué dans chaque puits.
- Couvrez la plaque d’un joint en aluminium pour protéger les perles de la lumière et incubez sur un agitateur à plaque à température ambiante pendant 1 heure en secouant à 800 tr/min.
- Placez la plaque sur un séparateur de plaques magnétique pendant 1 minute.
- En gardant la plaque sur le séparateur de plaques magnétiques, retournez la plaque pour vider les puits, puis tapotez pour sécher sur une épaisse couche d’essuie-tout de laboratoire 3-4 fois.
note: Vous pouvez également aspirer manuellement les puits à l’aide d’une pipette multicanaux ou utiliser un laveur de plaques automatisé.
- Lavez chaque puits deux fois en suivant la procédure décrite aux étapes 10-12.
note: Retirez autant de tampon que possible avant de passer à l’étape suivante pour éviter une dilution potentielle de la réaction.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 50 μL de tampon de dosage dans chaque puits et agitez pendant 1 minute sur un agitateur à plaque à 800 tr/min. Streptavidine, R-phycoérythrine conjuguée (SAPE).
- Diluer le rapporteur SAPE à 4 μg/mL dans le tampon de dosage.
- Ajouter 50 μL de SAPE dilué dans chaque puits.
- Recouvrez la plaque d’un joint en aluminium pour protéger les billes et le SAPE de la lumière et incubez sur un agitateur à température ambiante pendant 30 minutes en secouant à 800 tr/min.
- Placez la plaque sur un séparateur de plaques magnétique pendant 1 minute.
- En gardant la plaque sur le séparateur de plaques magnétiques, retournez la plaque pour vider les puits, puis tapotez pour sécher sur une épaisse couche d’essuie-tout de laboratoire 3-4 fois.
REMARQUE : Vous pouvez également aspirer manuellement les puits à l’aide d’une pipette multicanaux ou utiliser un laveur de plaques automatisé.
- Lavez chaque puits deux fois en suivant la procédure décrite aux étapes 10 à 12.
- Ajouter 100 μL de PBS-TBN dans chaque puits et agiter pendant 1 minute sur un agitateur à plaque à 800 tr/min.
- Analysez 50 μL de chaque réaction sur l’analyseur Luminex (conformément au manuel d’utilisation de l’analyseur utilisé), en recueillant un minimum de 50 billes par ensemble de billes pour l’analyse. Vous trouverez ci-dessous une brève description du xMAP INTELLIFLEX®.
- Sélectionnez le menu déroulant dans le coin supérieur gauche de l’écran et accédez à Configuration de la plaque.
- Sélectionnez Exécuter la plaque.
- Sélectionnez l’icône Éjecter pour éjecter le support de plaque.
- Chargez la plaque sur le support de plaque et sélectionnez l’icône Se rétracter pour rétracter le support de plaque.
- Sélectionnez l’icône Exécuter pour exécuter la plaque.
