Isolement et digestion des protéines neutrophiles

Résumé

Cette vidéo montre l’isolement des protéines des neutrophiles, qui sont ensuite transformées et digérées en peptides plus petits. Ces peptides peuvent être utilisés pour des analyses futures.

Protocole

1. Collecte et lyse des cellules neutrophiles

1. Prélever des cellules HL60 différenciées par les neutrophiles dans un tube de 15 mL par centrifugation d’échantillons à 400 x g pendant 5 min.
   note: Les neutrophiles doivent avoir une confluence de 3,5 x 10⁵ cellules/mL après la différenciation. Récoltez environ cinq millions de cellules pour l’extraction totale du protéome.
2. Jetez le surnageant et ajoutez 15 ml de solution tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube.
3. Centrifuger les échantillons à 400 x g pendant 5 min.
4. Répétez les étapes 1.2 à 1.3.
   note: Les échantillons de cellules peuvent être congelés avec de l’azote liquide et stockés à -80 °C après l’étape 1.4, en fonction de la période expérimentale.
5. Ajouter 300 μl de chlorhydrate d’aminométhane Tris (hydroxyméthyle) froid de 100 mM (Tris-HCl) pH 8,5 contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéinase (PIC) comprimé à chaque échantillon.
6. Vortex échantillonne brièvement.
7. Ajouter 1/10 volume de 20 % de SDS à une concentration finale de 2 % de SDS.
8. Pour lyser des échantillons de cellules, sondez des échantillons de sonicate dans un bain de glace pendant 30 secondes et 30 secondes pendant cinq cycles à 10 % de puissance.
9. Centrifuger les échantillons sur une courte rotation (vitesse maximale de 5 à 10 secondes).
   note: Ne laissez pas les débris cellulaires s’agglomérer. Utilisez un court essorage pour recueillir le spray sur les parois du tube.
10. Transférez les échantillons du tube de 15 mL dans un tube de 2 mL.
11. Ajouter 1/10 volume de 1 M de Dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 10 mM de DTT.
12. Vortex échantillonne brièvement.
13. Incuber les échantillons pendant 10 min avec agitation à 800 tr/min à 95°C.
14. Après 10 min, refroidir les échantillons à température ambiante.
    note: Les échantillons peuvent être placés dans de la glace pour accélérer le processus de refroidissement.
15. Ajouter 1/10 volume de 0,55 mM d’iodoacétamide (IAA) à une concentration finale de 55 mM IAA.
    note: Effectuez l’étape 1.15 dans l’obscurité pour éviter d’exposer l’IAA à la lumière.
16. Vortex échantillonne brièvement.
17. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 20 min dans l’obscurité.
18. Ajoutez de l’acétone glacée à 100 % à une concentration finale de 80 % et conservez les échantillons à -20 °C pendant la nuit.
    note: Le stockage à -20 °C peut être effectué jusqu’à deux semaines si nécessaire.

2. Digestion des protéines neutrophiles

1. Centrifuger des échantillons à 13 500 tr/min à 4 °C pendant 10 min pour précipiter les pastilles cellulaires.
2. Jeter les pastilles de surnageant et de laver les cellules avec 500 μl d’acétone glacée à 80 %.
3. Centrifugez les échantillons à 13 500 tr/min à 4 °C pendant 10 min et retirez le surnageant.
4. Répétez les étapes 2.1 à 2.3.
5. Granulés séchés à l’air.
6. Une fois sec, ajoutez 100 μl d’urée/40 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) à la pastille cellulaire et de l’eau sonicate dans un bain-marie à 4 °C pendant 30 secondes par intermittence, pendant 15 cycles pour résolbiliser les granules de protéines.
7. L’utilisation du dosage de l’albumine sérique bovine (BSA) (ou l’équivalent) permet de quantifier la concentration en protéines selon les instructions du fabricant.
8. Ajouter 300 μl de bicarbonate d’ammonium (ABC) pour diluer l’échantillon jusqu’à une concentration finale de 2 M d’urée.
9. Pour digérer 50 μg de protéines, ajoutez 1:50 de trypsine/LysC (rapport enzyme/protéine) aux échantillons sur de la glace et mélangez les échantillons en tapotant doucement.
10. Incuber les échantillons à température ambiante pendant la nuit pour effectuer la digestion.

Résultats

Graphique 1. Flux de travail de cellules HL60 différenciées en neutrophiles pour le profilage protéomique basé sur la spectrométrie de masse. Des lignées cellulaires HL60 indifférenciées et différenciées (via stimulation chimique DMSO) ont été cultivées, collectées et traitées pour l’extraction totale du protéome. Les protéines ont été digérées avec de la trypsine/LysC, et les peptides ont été...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube Falcon de 15 ml	VWR	Référence 470225-000
25 mL Sérologique	Fisher Scientific	14955235
Bicarbonate d’ammonium (ABC)	ThermoFisher Scientific	Réf. A643-500
acétone	Sigma Aldrich	Référence 34850-1L
Kit de dosage BSA	VWR	CA62408-940
Centrifugeuse 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	Réf. R0861	Préparez un stock de 1 m d’aliquotes DTT et stockez-le à -20°C
Sérum fœtal bovin (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Décongeler, préparer les aliquotes et les conserver à -20°C
Bloc chauffant
HEPES	Sigma Aldrich	N° H3375	Préparez des aliquotes d’urée 8M/40m d’HEPES, conservez-les à -20 °C
Iodoacétamide (IAA)	Fisher Scientific	AAA1471514	Préparez un stock de 0,55 m d’aliquotes IAA et conservez-le à -20°C. Évitez l’exposition à la lumière
L-glutamine	Fisher Scientific	25030081	Décongeler, préparer les aliquotes et les conserver à -20°C
azote liquide
LoBind Microtubes à centrifuger	Eppendorf	Tél. : 13-698-794
Pénicilline, streptomycine, amphotéricine	Sigma Aldrich	A5955	Décongeler, préparer les aliquotes et les conserver à -20°C
Cellules HL60 différenciées par les neutrophiles
Solution tamponnée au phosphate (PBS)	Boutique bio	PBS408 (en anglais seulement)	Conserver à température ambiante
Sonde sonicatrice	Fisher Scientific	Tél. : 100-132-894
Cocktail d’inhibiteurs de protéase (PIC) comprimé	Sigma Aldrich	5892791001	Conserver à 4°C
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Conserver à 4°C
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	ThermoFisher Scientific	J18220. N° A1	préparer une solution SDS à 2 %
Centrifugeuse SpeedVac	Eppendorf	Tél. : 07-748-15
Flacons T75	ThermoFisher Scientific	156499
Tris HCL pH 8,5	Fisher Scientific	BP152-1	Conserver à 4°C
Bain à ultrasons	VWR	Référence 97043-960
urée	Boutique bio	URE001.1