Une procédure de pointe STAGE pour le dessalage et la purification des peptides

Résumé

Cette vidéo montre la purification peptidique par la procédure STAGE Tip. Une colonne miniature contenant des billes de résine liées à de longues chaînes d’hydrocarbures facilite la purification basée sur l’interaction hydrophobe. Lors du chargement d’un échantillon de peptide prédigéré dans la colonne, les fragments de peptide se lient aux billes de résine, laissant passer les impuretés. Un tampon d’élution qui perturbe l’interaction hydrophobe est appliqué pour éluer les fragments peptidiques.

Protocole

1. Purification et dessalage des peptides

1. Emballez trois couches de résine C18 dans une pointe de pipette de 200 μl pour chaque échantillon de peptide afin de construire une pointe d’extraction STop And Go (STAGE).
2. Ajouter 1/10 de solution d’arrêt (20 % d’acétonitrile [ACN)] et d’acide trifluoroacétique [TFA]) aux échantillons.
3. Échantillons par centrifugation pour la précipitation des granulés à 13 200 tr/min pendant 10 min.
4. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 2 mL et jetez la pastille.
5. Pointes de l’étape de lavage avec 100 μl de 100 % d’ACN.
6. Centrifugeuse STAGE pointes à 1000 x g pendant 2 min.
   note: La centrifugeuse STAGE pointe jusqu’à ce que tout le liquide ait traversé la résine C18.
7. Laver les pointes STAGE avec 50 μl de tampon B (80 % d’ACN, 0,5 % d’acide acétique et ddH₂O).
8. La centrifugeuse STAGE pointe à 1000 x g pendant 2 min.
9. Laver les pointes STAGE avec 200 μl de tampon A (2 % ACN, 0,1 % TFA, 0,5 % d’acide acétique et ddH₂O).
10. Pointes de l’étage de centrifugation à 1000 x g pendant 2 min.
11. Chargez des échantillons dans les pointes STAGE.
12. Centrifuger les échantillons à 1000 x g pendant 3 à 5 min.
13. Laver les pointes STAGE avec 200 μl de tampon A.
14. Centrifugeuse à 1000 x g pendant 3 à 5 min.
15. Ajouter 50 μl de tampon B dans chaque pointe STAGE
16. À l’aide d’une seringue, éluer des échantillons contenant le tampon B dans un tube de bandelette PCR de 0,2 ml.
17. Une fois les échantillons élués, séchez les peptides à l’aide d’une centrifugeuse sous vide pendant 45 minutes.
18. Une fois les échantillons secs, conservez-les à température ambiante jusqu’à MS.
    note: Si le stockage des peptides est nécessaire pendant plus de deux semaines, nous vous suggérons de le conserver à -20°C.
19. Analysez l’échantillon sur une spectrométrie de masse (MS) à haute résolution.
    note: Les paramètres de mesure de l’échantillon (p. ex., quantité d’échantillon chargée, longueur du gradient de chromatographie en phase liquide, résolution) dépendront de l’instrumentation utilisée.

2. Profilage protéomique des neutrophiles

1. Traitement des données brutes
   1. Téléchargez les fichiers de données brutes obtenus de MS dans MaxQuant.
   2. Le logiciel est conçu pour fonctionner avec des fichiers d’acquisition ascendants dépendants des données, et de nombreux paramètres par défaut sont optimisés pour de tels échantillons. Les paramètres par défaut comprennent la digestion (trypsine P), les modifications variables de l’oxydation de la méthionine (oxydation (M)) et de la N-acétylation des protéines (acétyle (Protein N-term)), et les modifications fixes de la carbamidométhylation de la cystéine (carbamidométhyl (C)).
   3. Les ajustements de ces paramètres comprennent la quantification sans marquage (LFQ ; définir le nombre minimum de rapports sur 1), la correspondance entre les cycles (c’est-à-dire marche/arrêt) et un nombre minimum de peptides identifiés par protéine (réglage recommandé sur 2).
   4. Dans les paramètres globaux, importez le fichier FASTA pour l’identification de la séquence. Pour cette expérience, le fichier FASTA Homo sapiens (Humain) (UP000005640) de la base de données Uniprot a été utilisé. note: Consigner les renseignements suivants aux fins de tenue de dossiers : ID de l’organisme = 9606 ; le nombre de protéines = 79 740 ; Date de téléchargement du fichier.
   5. Définissez le nombre de cœurs d’ordinateur à utiliser pour le traitement et sélectionnez Démarrer.
   6. Une fois MaxQuant terminé, un dossier 'combiné', ainsi que d'autres fichiers, seront générés.
      note: Les autres fichiers peuvent être utilisés pour identifier des peptides, des modifications, etc., et peuvent être nécessaires pour télécharger l’ensemble complet des données dans des référentiels de données, y compris Proteome Xchange (PRIDE).
2. Analyse et visualisation des données dans Perseus
   1. Téléchargez le 'proteingroups.txt' dans Perseus et sélectionnez tous les fichiers d'intensité LFQ pour la fenêtre 'Main'.
      note: Les informations de base sont importées directement dans les fenêtres Perseus, mais d’autres informations (par exemple, les sites de modification) peuvent devoir être ajoutées manuellement.
   2. Filtrez les rangées en éliminant les contaminants, les peptides inverses et les peptides identifiés uniquement par site.
   3. Transformez les données par le log₂(x).
   4. Pour observer le nombre de protéines détectées dans chaque répétition, construisez un diagramme de Venn numérique.
   5. Définir des annotations catégorielles pour chaque sample.
      note: À des fins statistiques, toutes les répétitions d’un échantillon biologique doivent porter le même nom.
   6. Filtrez les lignes en fonction des valeurs valides, avec la protéine identifiée dans >50 % des répétitions et dans au moins un group.
      note: Le filtrage par valeurs valides peut être plus strict, en fonction de la configuration et des objectifs de l’expérience (par exemple, la protéine doit être présente dans tous les échantillons).
   7. Pour remplacer les valeurs manquantes pour LFQ, l’imputation à partir de la distribution normale peut être effectuée.
      REMARQUE : les paramètres par défaut sont optimisés pour les données LFQ mais peuvent être ajustés à volonté.
   8. Ajoutez des informations d’annotation aux lignes de protéines. Ajoutez le fichier FASTA txt.gz (obtenu sur le site Web de Perseus) dans les dossiers 'bin', 'conf' et 'annotation' et apportez des termes spécifiques (par exemple, noms de protéines, noms de gènes, ontologie génétique).
   9. La matrice est maintenant complète et peut être utilisée pour des tests statistiques (p. ex., ANOVA, tests t) afin de déterminer les changements significatifs de l’abondance des protéines entre les conditions testées. D’autres formes d’outils de visualisation incluent les graphiques d’analyse en composantes principales, les cartes thermiques et l’enrichissement des catégories.
      note: Les informations d’annotation peuvent également être téléchargées à partir d’UniProt et intégrées dans le cadre Perseus.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube Falcon de 15 ml	VWR	Référence 470225-000
25 mL Sérologique	Fisher Scientific	14955235
Bicarbonate d’ammonium (ABC)	ThermoFisher Scientific	Réf. A643-500
acide acétique	Sigma Aldrich	1099510001
acétone	Sigma Aldrich	Référence 34850-1L
Acétonitrile (ACN), grade MS	percer	Réf. TS-51101
Kit de dosage BSA	VWR	CA62408-940
Disques C18 (pointes STAGE)	Fisher Scientific	13110019
Centrifugeuse 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	Réf. R0861	Préparez un stock de 1 m d’aliquotes DTT et stockez-le à -20°C
Sérum fœtal bovin (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Décongeler, préparer les aliquotes et les conserver à -20°C
HEPES	Sigma Aldrich	N° H3375	Préparez des aliquotes d’urée 8M/40m d’HEPES, conservez-les à -20 °C
Spectromètre de masse à haute résolution	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacétamide (IAA)	Fisher Scientific	AAA1471514	Préparez un stock de 0,55 m d’aliquotes IAA et conservez-le à -20°C. Évitez l’exposition à la lumière
L-glutamine	Fisher Scientific	25030081	Décongeler, préparer les aliquotes et les conserver à -20°C
LoBind Microtubes à centrifuger	Eppendorf	Tél. : 13-698-794
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
Tubes de bandelettes PCR	VWR	Référence 76318-802
Pénicilline, streptomycine, amphotéricine	Sigma Aldrich	A5955	Décongeler, préparer les aliquotes et les conserver à -20°C
Persée	https://www.maxquant.org/Perseus/
solution tamponnée au phosphate (PBS)	Boutique bio	PBS408 (en anglais seulement)	Conserver à température ambiante
Sonde sonicatrice	Fisher Scientific	Tél. : 100-132-894
Cocktail d’inhibiteurs de protéase (PIC) comprimé	Sigma Aldrich	5892791001	Conserver à 4°C
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Conserver à 4°C
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	ThermoFisher Scientific	J18220. N° A1	préparer une solution SDS à 2 %
Centrifugeuse SpeedVac	Eppendorf	Tél. : 07-748-15
Centrifugeuse basculante STAGE	Sonation	STC-V2
Flacons T75	ThermoFisher Scientific	156499
Acide trifluoroacétique	ThermoFisher Scientific	Référence 85183
Tris HCL pH 8,5	Fisher Scientific	BP152-1	Conserver à 4°C
Trypsine/LysC	Thermo Fisher Scientific	A40009	aliquote et conserver à -20°C
Bain à ultrasons	VWR	Référence 97043-960
urée	Boutique bio	URE001.1