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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Essai de neutralisation basé sur le pseudotype
REMARQUE : pMN est l’inhibition de la transduction médiée par le virus pseudotype (PV) via des échantillons de sérum de convalescent humain contenant des anticorps dirigés contre le Spike du SRAS-CoV-2.
- Dans une plaque blanche à 96 puits à l'aide d'une pipette multicanaux, ajoutez 50 μl de milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM), 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine (Pen/Streptomycine) aux rangées B à H, colonnes 1 à 12.
- Ajouter 5 μl de sérums de convalescents dans les puits de la rangée A, colonnes 2 à 10, pour un volume total de 100 μl de DMEM/10 % FBS/1 % P/S. Ajouter une quantité connue (p. ex., 5 μl) d’antisérums positifs (calibre NIBSC 20/162, HICC-pool 2 ou HICC 3) et négatifs (sérums de patients prélevés avant 2019) dans les puits A11 et A12 en tant que témoins.
- Retirez 50 μl des puits de la rangée A et effectuez des dilutions en série deux fois dans tous les puits situés en dessous.
- À chaque étape de dilution, utilisez une pipette multicanaux pour mélanger 5 à 10 fois en pipetant de haut en bas et en prenant soin de ne pas produire de bulles d’air.
- Une fois la dilution en série terminée, les 50 derniers μl du puits final de chaque colonne doivent être jetés.
REMARQUE : À ce stade, chaque puits doit contenir 50 μl de DMEM mélangé et des dilutions en série de sérums de patients ou de sérums témoins.
- Centrifuger la plaque pendant 1 min à 500 tr/min pour s’assurer qu’aucun liquide ne reste sur les parois du puits.
- À l’aide des données obtenues par titrage de pseudotype, calculez la quantité de DMEM nécessaire pour diluer votre PV SARS-CoV-2 afin d’obtenir 5 x 106 RLU dans 50 μl, avec un volume total de 5 ml.
- Mélanger cette solution photovoltaïque diluée dans un bassin de pipette à l’aide de la pipette multicanaux, et aliquote 50 μl dans chaque puits de la plaque, à l’exception des puits A6-A12 (contrôle de la cellule uniquement). A1-A6 servira de contrôle PV uniquement.
- Centrifuger la plaque pendant 1 min à 500 tr/min pour s’assurer qu’aucun virus ne reste sur les parois du puits.
- Incuber les plaques pendant 1 h à 37 °C à 5 % de dioxyde de carbone (CO2), ce qui laisse le temps au sérum de se lier à la glycoprotéine du SRAS-CoV-2.
- Préparez une plaque de cellules cibles HEK 293T/17 transfectées 24 h avant avec le plasmide d’expression de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) et les plasmides plasmides d’expression de la sérine protéase 2 (TMPRSS2).
- Retirer le milieu de culture de la plaque.
- Lavez la plaque deux fois avec 2 ml de PBS sur un côté du plat pour éviter le détachement des cellules et jetez-la.
- Ajoutez 2 ml de trypsine dans la plaque et placez la plaque dans l’incubateur jusqu’à ce que les cellules se détachent.
- Une fois les cellules détachées, ajoutez 6 ml de DMEM/10 % FBS/1 % pénicilline/streptomycine dans la plaque pour éteindre l’activité de la trypsine et remettre les cellules en suspension doucement.
- Comptez les cellules à l’aide du compteur de cellules automatisé TC20TM ou de la lame de la chambre de comptage et ajoutez 1 x 104 cellules dans un volume total de 50 μl dans chaque puits.
- Incuber la plaque pendant 48-72 h, à 37 °C, 5 % CO2.
- Lire la plaque à l’aide du système de dosage de la luciférase Bright GloTM sur un luminomètre à microplaques GloMax® Navigator en retirant le milieu de culture de tous les puits et en ajoutant 25 μl d’un mélange 1:1 de PBS : réactif de dosage de la luciférase Bright GloTM.
- À partir des données brutes fournies par le luminomètre, calculez les titres d’anticorps neutralisants à la demi-concentration inhibitrice maximale (CI50) à l’aide de protocoles établis. Les valeurs de CI50 inférieures à une dilution de 1:40 sont considérées comme négatives. Les données peuvent également être évaluées à l’aide d’AutoPlate.