Isolement de lymphocytes T tueurs naturels invariants à partir d’un modèle murin

Résumé

Source : Meng, M., et al. Immunothérapie adoptive des cellules iNKT chez les souris PR induites par la glucose-6-phosphate isomérase (G6PI).J. Vis. Exp.(2020)

Cette vidéo illustre une méthode permettant d’isoler des lymphocytes T tueurs naturels invariants, également connus sous le nom de cellules iNKT. La procédure commence par l’injection d’un glycolipide synthétique dans une souris pour stimuler l’activation et la prolifération des cellules iNKT dans la rate. Par la suite, des suspensions unicellulaires sont préparées à partir de la rate et incubées avec des complexes de reconnaissance des cellules iNKT marqués avec des fluorophores, suivis d’une séparation à base de billes magnétiques, pour isoler les cellules iNKT.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Obtention de lymphocytes T tueurs naturels invariants (cellules iNKT) avec la thérapie cellulaire adoptive

1. Induction directionnelle des cellules iNKT
   1. Injecter par voie intrapéritonéale du α-galactosylcéramide (α-GalCer) (0,1 mg/kg de poids corporel).
2. Isolement des cellules iNKT
   1. Trois jours après la modélisation, injecter par voie intrapéritonéale du pentobarbital sodique à 1 % (50 mg/kg de poids corporel) pour l’anesthésie. Les souris correctement anesthésiées ne montrent pas de réponse de retrait de la patte arrière à un pincement de l’orteil.
   2. Isolez la rate d’une souris DBA/1 après l’avoir injectée par voie intrapéritonéale avec α-GalCer. Préparez une suspension unicellulaire en coupant et en broyant la rate dans un tamis de 200 mailles.
   3. Laver la suspension cellulaire avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), centrifuger à 200 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Répéter.
   4. Remettre les cellules en suspension avec 1 mL de solution de dilution de sang total et de tissus. Ajouter 3 mL de milieu de séparation des lymphocytes de souris, puis centrifuger les cellules pendant 20 min à 300 x g à température ambiante.
   5. Prélevez la couche de lymphocytes blanc laiteux (c’est-à-dire la deuxième couche en partant du haut), lavez-la 2 fois avec du PBS et comptez avec un compteur de cellules automatisé.
3. Stratégie de sélection positive par tri cellulaire activé magnétique (MACS) pour la purification des cellules iNKT
   note: Pour le prétraitement des tétramères CD1d, 1 mg/mL de α-Galcer a été dilué à 200 μg/mL avec 0,5 % de Tween-20 et 0,9 % de NaCl, et 5 μL de la solution résultante ont été ajoutés à 100 μL de la solution de tétramère CD1d. Le mélange a été incubé pendant 12 h à température ambiante et placé à 4 °C pour être utilisé. Le récepteur des lymphocytes T (TCR) β a été dilué 80 fois avec de l’eau désionisée. Tous les autres anticorps ont été utilisés comme solution mère.
   1. Remettez en suspension 10 à⁷ cellules avec 100 μL de PBS à 4 °C, ajoutez 10 μL de CD1d Tetramer-phycoerythrine chargée de α-GalCer (CD1d Tetramer-PE) et incuberez-les à 4 °C pendant 15 min dans l’obscurité.
   2. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS et mettez-les en suspension dans 80 μL de PBS.
   3. Ajoutez 20 μL de microbilles anti-PE et incubez-les à 4 °C pendant 20 min dans l’obscurité.
   4. Lavez-les 2 fois avec du PBS et remettez les cellules en suspension avec 500 μL de PBS.
   5. Placez la colonne de tri dans le champ magnétique du trieur MACS et rincez avec 500 μL de PBS.
   6. Ajoutez la suspension cellulaire de l’étape 1.3.4 à la colonne de tri, collectez le flux et rincez 3 fois avec un tampon PBS.
   7. Supprimez le champ magnétique et récupérez les cellules de la colonne de tri. À ce stade, ajoutez 1 mL de tampon PBS dans la colonne de tri et poussez rapidement le piston à pression constante pour conduire les cellules marquées vers le tube de collecte et obtenir des cellules iNKT purifiées. Comptez avec un compteur de cellules automatisé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microbilles anti-PE	Miltenyi	Tél. : 130-048-801	Allemagne
colonnes	Miltenyi	ms	Allemagne
Centrifugeuse cryogénique	Beckman	Allegra® X-15R	Amérique
Souris CD1d Tetramer-PE	MBL	TS-MCD-1	Japon
Percoll souris	Solarbio	Réf. P8620	Chine
Microscope optique	Olympe	Olympe-II	Japon