Une technique ex vivo pour fabriquer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique

Résumé

Source : Ghassemi, S., et al. Fabrication de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) pour l’immunothérapie adoptive. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente une technique de fabrication ex vivo de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR). Les lymphocytes T humains sont incubés avec des billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28, ainsi qu’un milieu complété par l’interleukine-2 (IL-2), conduisant à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T. Des vecteurs lentiviraux transgéniques sont introduits, ce qui permet à l’ARN transgénique de s’intégrer dans le génome de l’hôte et d’exprimer le transgène. Il en résulte que les lymphocytes T transduits expriment des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) à leur surface. Les lymphocytes T sont récoltés à des moments précis pour évaluer l’expression des CAR et la cryoconservation.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Activation, transduction et expansion des lymphocytes T

1. Activer les lymphocytes T humains primaires frais ou cryoconservés en les mélangeant avec des billes magnétiques anti-CD3/CD28 (par exemple, des dynabilles) à raison de 3 billes par lymphocyte T dans des boîtes de culture cellulaire à 6 puits. Cellules T de culture dans le milieu X-VIVO 15 complétée par 5 % de sérum AB humain normal, 2 mM de L-glutamine, 20 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) et d’interleukine 2 (IL2, 100 unités/mL). Maintenir les lymphocytes T à une concentration de 10^{à 6} lymphocytes T/mL pendant l’expansion. Cultivez des lymphocytes T à 37 °C, 20 % d’O₂ et 95 % d’humidité avec 5 % de CO₂.
2. Après une nuit de stimulation, ajoutez du surnageant lentiviral aux lymphocytes T activés. Calculer le volume de surnageant nécessaire pour obtenir une multiplicité d’infection (MOI) de 3−5,
   note: Le plasmide du lentivirus CAR CD19-BBζ se compose d’une charnière CD8, d’un domaine de costimulation 4-1BB et d’un domaine de signalisation CD3ζ. Le surnageant lentiviral CD19-BBζ a été généré comme décrit précédemment.
3. Le jour 3, prélever une aliquote représentative des cellules pour la cryoconservation. Avant la cryoconservation, retirez les billes magnétiques par pipetage doux et séparation magnétique. Préparez un milieu de congélation contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 0,5 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
   1. Centrifugez les lymphocytes T à 300 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant et ajoutez 5 mL de PBS. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min et jetez le PBS.
   2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de cryoconservation froid. Congelez les lymphocytes T dans un récipient de congélation réfrigéré et conservez-les à -80 °C pendant 48 h. Transférez les cellules congelées dans de l’azote liquide.
4. Lavez le reste des lymphocytes T une fois dans 5 ml de PBS pour éliminer le vecteur résiduel. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Décantez le PBS et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture de cellules T à une concentration de 0,5 x 10⁶ cellules/mL.
5. Divisez les lymphocytes T en deux cultures, désignées pour le jour 5 et le jour 9. Compter les lymphocytes T par cytométrie en flux à l’aide de billes de comptage (Table des matériaux) et d’anticorps monoclonaux dirigés contre les CD4 et CD8 humains, ainsi que d’un colorant de viabilité (Table des matériaux).
   1. Pour mesurer la concentration des lymphocytes T, préparez un mélange maître contenant 500 μL de PBS, 5 μL de billes de comptage, 10 μL de solution de viabilité des cellules 7-amino-actinomycine D, 4 μL d’isothiocyanate de fluorescéine CD4 (FITC) et 4 μL d’allophycocyanine CD8 (APC). Ajoutez 40 μL de lymphocytes T au mélange maître et mesurez la concentration cellulaire par cytométrie en flux en fonction du nombre de lymphocytes T vivants/nombre de billes. Nourrir à nouveau pour maintenir les cultures à une concentration de 0,5 x 10⁶ cellules/mL tous les deux jours.
6. Le jour 5, comptez et cryoconservez les cultures du jour 5 comme décrit aux étapes 1.3 et 1.5.
7. Le jour 7, laver 0,5 x 10^{cellules T 6} dans du PBS et les remettre en suspension dans 100 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Détecter l’expression des protéines de surface CAR par immunomarquage avec un idiotype anti-CAR19 conjugué par fluorescence par cytométrie en flux.
8. Le jour 9, comptez les cultures du jour 9 et cryoconservez comme décrit à l’étape 1.3.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Billes anti CD3/CD28	Thermo Fisher	Réf. 40203D
Souris APC Anti-Human CD8	BD Biosciences	555369	RRID : AB_398595
APC-H7 Anticorps anti-CD8 humain de souris	BD Biosciences	560179	RRID : AB_1645481
Perles de comptage absolues CountBright,	Invitrogen	Réf. C36950
HEPES	Gibco	Référence 15630-080
Sérum AB humain	Valley Biomedical	Motomarine HP1022
IL-2 IS humain, qualité supérieure	Miltenyi	Tél. : 130-097-744
L-glutamine	Gibco	Référence 28030-081
Compteur de socs multisizer	Beckman Coulter
X-VIVO 15	Gibco	04-418Q