Amélioration de la transduction virale dans les cellules tueuses naturelles à l’aide d’un polymère cationique

Résumé

Source : Nanbakhsh, A., et al. Le dextran améliore l’efficacité de la transduction lentivirale des cellules NK primaires murines et humaines. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente un test de transduction virale médiée par un polymère cationique dans des cellules tueuses naturelles (NK). Les cellules sont incubées avec des vecteurs de lentivirus transgéniques codant pour une protéine fluorescente. L’ajout d’un polymère cationique permet au virus de se fixer aux cellules et d’intégrer son ARN dans le génome de l’hôte, exprimant la protéine fluorescente. La fluorescence est quantifiée pour évaluer l’amélioration de la transduction induite par les polymères.

Protocole

1. Transduction de cellules NK primaires murines et humaines avec le lentivirus

1. Mettre en suspension des cellules NK primaires de souris ou d’humains dans une plaque à 24 puits à 0,5 × 10⁵/mL de milieu en présence d’un surnageant de lentivirus à protéine fluorescente verte (GFP) à 5, 10 et 20 multiplicité d’infection (MOI) et en présence de Pb (8 μg/mL), de PS (8 μg/mL) ou de dextran (8 μg/mL).
2. Centrifuger les plaques à 1 000 × g pendant 60 min.
3. Sans décanter le surnageant, cultivez les cellules pendant une nuit (16-18 h) dans un incubateur à 37 °C imprégné de 5,2 % de CO₂.
4. Laver avec 10 mL de PBS et remettre en suspension dans 2 mL de milieu de culture complet du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 en présence d’interleukine 2 (IL-2, 300 U/mL).
5. Récoltez les cellules NK transduites le jour 7 en tapotant doucement les flacons.
   1. Activez les cellules récoltées avec des concentrations titrées d’anticorps monoclonaux antinaturels du groupe 2D (NKG2D) (A10) en enrobant pendant la nuit des plaques de polystyrène à 96 puits hautement absorbant les protéines avec des concentrations de 2,5 μg/mL d’anticorps monoclonaux anti-NKG2D.
   2. Lavez chaque puits avec 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) trois fois avant d’ajouter les cellules NK primaires.
6. Prélever les surnageants de culture à l’aide d’une pipette multicanaux entre 16 et 18 heures après l’activation pour quantifier les cytokines telles que l’interféron gamma (IFN-γ). Générez des courbes standard à l’aide des cytokines recombinantes fournies avec les kits de test immuno-enzymatique (ELISA).
7. Testez la viabilité des cellules NK à l’aide de la coloration à l’annexine-V/7-amino-actinomycine D (7-AAD) et déterminez le pourcentage de cellules nécrotiques parmi les cellules NK transformées à l’aide d’un cytomètre en flux.
   1. Pour effectuer ce test, prélever les cellules NK murines et humaines quatre jours après la transduction, laver deux fois avec 10 ml de PBS froid à 500 × g pendant 5 minutes chacune, et incuber avec un kit Annexin-V (PE)/7-AAD.
8. Utilisez un logiciel de cytométrie en flux approprié pour analyser les données. Sélectionnez la population de cellules vivantes et analysez l’expression de la GFP (canal de l’isothiocyanate de fluorescéine [FITC]) comme mesure de la transduction virale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
dextrane	Sigma-Aldrich	Référence 90-64-91-9
Polybrène (Pb)	Sigma-Aldrich	TR-1003
Sulfate de protamine (PS)	Sigma-Aldrich	p3369 (traduction
RPMI1640	Corning	10-040-CV
Interféron gamma (IFN-γ )	eBiosciences	Tél. : 14-7311-85
Solution de coloration au propidium lodide	Bd	Référence 51-66211E
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000015
L’isoflurane	phénix	NDC 57319-559-05
293Lymphocytes T	ATCC	CRL-3216
Fioles T75	Corning	Réf. 430641U
Kits ELISA	Ebiosciences	Tél. : 00-4201-56