Transfection de macrophages primaires avec de l’ARNm modifié

Résumé

Source : Herb, M. et al., Transfection hautement efficace de macrophages primaires avec de l’ARNm transcrit in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre le processus de transfection de macrophages primaires avec un ARNm modifié codant pour une protéine fluorescente verte. Ces ARNm modifiés, conçus pour réduire l’immunogénicité et améliorer sa stabilité, assurent la transfection réussie et l’expression ultérieure des protéines fluorescentes vertes, ce qui est confirmé par la microscopie à fluorescence.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes avec des gants. Effectuez toutes les étapes de transfection sous une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination des cellules. Avant de travailler avec de l’ARNm, nettoyez tous les instruments tels que les pipettes et toutes les surfaces avec de l’éthanol à 70 % et/ou un tensioactif dégradant l’ARNase (tableau des matériaux). Assurez-vous que tous les tubes de réaction sont exempts d’ARNASE et stériles. N’utilisez que de l’eau stérile sans RNAase pour les dilutions. Utilisez exclusivement des pointes de pipette avec filtres. Changez les pointes de pipette après chaque étape de pipetage.

1. Génération de la matrice d’ADN

REMARQUE : Le modèle d’ADN pour la transcription in vitro de l’ARNm utilisant ce protocole doit contenir une séquence promotrice T7 pour permettre l’amarrage de l’ARN polymérase. Si le plasmide contenant la séquence d’ADN de la protéine d’intérêt contient déjà une séquence promotrice T7 correctement orientée directement en amont de la séquence d’intérêt, la linéarisation du plasmide (voir étape 1.1.) doit être effectuée. Sinon, attachez un promoteur T7 à la séquence d’intérêt par réaction en chaîne par polymérase (PCR, voir étape 1.2.).

1. Linéarisation de plasmides contenant des promoteurs T7
   1. Linéariser des plasmides contenant déjà une séquence promotrice T7 correctement orientée par digestion avec une enzyme de restriction coupant en aval du codon stop de la séquence d’intérêt. Sinon, la transcription ne se terminera pas correctement après la séquence d’intérêt.
      REMARQUE : Il est préférable d'utiliser des enzymes de restriction laissant des extrémités émoussées ou des surplombs de 5 '.
   2. Confirmer la linéarisation complète du plasmide par électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN plasmidique non digéré par rapport à l’ADN plasmidique digéré.
   3. Purifier l’ADN plasmidique linéarisé avant de l’utiliser comme matrice d’ADN pour la transcription in vitro de l’ARNm à l’aide d’un kit de purification de l’ADN (Table des matériaux).
2. Fixation du promoteur T7 par PCR
   1. Utilisez une amorce directe contenant les composants suivants (dans l'ordre indiqué de 5' à 3') : environ 5 pb aléatoires en amont du promoteur (par exemple, GAAAT) ; la séquence promotrice T7 (TAATACGACTCACTATAG) ; deux G supplémentaires pour une efficacité de transcription accrue (GG) ; la partie spécifique de la séquence cible qui est homologue à la séquence plasmidique entourant le codon de départ.
      note: Il doit être composé de 3 à 6 pb en amont de la séquence KOZAK et du codon de départ, de la séquence KOZAK et du codon de départ (généralement GCCACC ATG G), de 12 à 18 pb en aval du codon de départ. Si la séquence d’intérêt ne contient pas déjà une séquence KOZAK ou un codon de départ, ceux-ci peuvent être attachés à cette étape en les incluant simplement dans la séquence d’amorces.
   2. Calculez le t_m de l’amorce directe uniquement en tenant compte de la pièce homologue à la séquence cible.
   3. Pour évaluer la formation des dimères/épingles à cheveux, utilisez toute la séquence d’amorces, qui peut facilement dépasser 50 pb.
   4. Utilisez une amorce inverse située quelque part en aval du codon stop.
      REMARQUE : Si la séquence d'intérêt ne contient pas déjà un codon stop, il peut être attaché à cette étape en l'incluant simplement dans la séquence d'amorces.
   5. Utilisez les amorces avant et arrière pour effectuer une PCR à l’aide d’une polymérase haute fidélité avec relecture (Table des matériaux).
   6. Confirmer la génération d’un seul produit et de la taille de l’amplicon par électrophorèse sur gel d’agarose (p. ex., utiliser un gel d’agarose à 1 % et un courant constant de 100 V).
   7. Purifier le produit de PCR avant de l’utiliser comme matrice d’acide désoxyribonucléique (ADN) pour la transcription in vitro de l’acide ribonucléique messager (ARNm) à l’aide d’un kit de purification d’ADN.

2. Génération d’ARNm

1. Décongeler tous les composants du kit de transcription in vitro de l’ARNm (voir le tableau des matériaux). Vortex pendant 5 s et rotation descendante pendant 2 s à 2 000 x g. Garder sur la glace jusqu’à utilisation.
2. Préparez le mélange réactionnel pour la transcription in vitro de l’ARNm dans un tube de microcentrifugation de 0,5 mL dans l’ordre suivant (volume total de 40 μL) : 20 μL de 10 analogues de la coiffe anti-retour/nucléoside triphosphate (ARCA/NTP) (inclus dans le kit de transcription in vitro de l’ARNm) ; 0,25 μL de 5-méthyl-cytidine triphosphate (5-mCTP) (la concentration finale (f.c.) est de 1,25 mM ; 50 % du CTP total) ; 0,25 μL de pseudo-uridine triphosphate (pseudo-UTP) (f.c. est de 1,25 mm; 50 % du total des PCD) ; X μL de matrice d’ADN ; 2 μL de mélange d’ARN polymérase T7 (inclus dans le kit de transcription in vitro de l’ARNm) ; Y μL de H₂O. sans ARN
   REMARQUE : X est un volume contenant au moins 1 μg d’ADN. Par exemple, 1,6 μL à partir d’une solution mère de 625 ng/μL. Y est le volume de réserve par rapport au volume total de 40 μL.
3. Vortex pendant 5 s et rotation descendante pendant 2 s à 2 000 x g. Incuber à 37 °C pendant 30 min à 400 tr/min sur un mélangeur thermique pour la transcription in vitro.
4. Ensuite, ajoutez 2 μL de DNase I directement dans le mélange réactionnel pour éliminer l’ADN matrice. Vortex pendant 5 s et rotation descendante pendant 2 s à 2 000 x g.
5. Incuber à 37 °C pendant 15 min à 400 tr/min sur un mélangeur thermique. Prélever une aliquote de 2 μL pour le gel de contrôle (étape 3.3) et conserver à -80 °C.
6. Pour les résidus poly(A), ajoutez les composants suivants directement dans le mélange réactionnel précédent (jusqu’à un volume final de 50 μL) : 5 μL de tampon de réaction poly(A) polymérase 10x et 5 μL de poly(A) polymérase (tous deux inclus dans le kit de transcription in vitro de l’ARNm). Vortex pendant 5 s et rotation descendante pendant 2 s à 2 000 x g.
7. Incuber le mélange à 37 °C pendant 30 min à 400 tr/min sur un thermomixeur. Prélever une aliquote de 2 μL pour le gel de contrôle (étape 3.3) et conserver à -80 °C.
8. Pour la déphosphorylation des extrémités 5' de l’ARNm, ajoutez les composants suivants directement dans le mélange réactionnel précédent (jusqu’à un volume final de 60 μL) : 3 μL de H₂O sans ARNASE ; 6 μL de tampon de réaction 10x phosphatase antarctique ; 3 μL de phosphatase antarctique (15 unités pour un volume de réaction de 60 μL). Vortex pendant 5 s et rotation descendante pendant 2 s à 2 000 x g.
9. Incuber l’enrobé à 37 °C pendant 30 min à 400 tr/min sur un mélangeur thermique.
10. Phosphatase antarctique inactivée par la chaleur par incubation à 80 °C pendant 2 min
    note: Idéalement, utilisez un mélangeur thermique séparé, n’attendez pas que le premier mélangeur atteigne la température souhaitée.

3. Purification de l’ARNm

1. Purifier l’ARNm transcrit in vitro à l’aide d’un kit de purification d’ARN dédié (Table des Matériaux).
   1. Ajouter X μL de solution d’élution au mélange réactionnel de l’ARNm à partir de l’étape 2.10. Mélanger en inversant 5 fois. Ajouter 300 μL de concentré de solution liante. Mélanger par pipetage doux 5 fois.
      REMARQUE : X est le volume de réserve jusqu’à un volume total de 100 μL. Par exemple, ajoutez une solution d’élution de 40 μL à un mélange réactionnel d’ARNm de 60 μL.
   2. Ajouter 100 μL d’éthanol sans RNAase. Mélanger par pipetage doux 5 fois.
   3. Placez une colonne filtrante dans l’un des tubes de collecte fournis. Transférez doucement le mélange de réaction de l’ARNm au centre du filtre sans toucher le filtre. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à température ambiante (RT).
   4. Soulevez délicatement la colonne filtrante et jetez le flux dans le tube de collecte. Replacez la colonne filtrante dans le même tube de collecte.
   5. Ajouter 500 μL de solution de lavage (n’oubliez pas d’ajouter 20 ml d’éthanol sans RNAase avant d’utiliser la solution de lavage pour la première fois).
   6. Centrifuger à 15 000 x g pendant 1 min à RT. Répéter les étapes 3.1.4 à 3.1.6 pour laver une fois de plus.
   7. Centrifuger à pleine vitesse (17 900 x g) pendant 1 min à RT pour éliminer tout fluide résiduel de la colonne de filtre. Retirez délicatement la colonne de filtre du tube de collecte. Placez la colonne filtrante dans un nouveau tube de collecte.
   8. Ajoutez 50 μL de tampon d’élution au centre du filtre sans toucher le filtre. Incuber à 65 °C pendant 10 min sur un mélangeur thermique.
   9. Centrifuger à 15 000 x g pendant 1 min à RT. Retirez la colonne de filtre et jetez-la.
2. Mesurer la concentration et la pureté de l’ARNm élué, par exemple à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume pour mesurer l’absorbance à 260 et 280 nm.
   REMARQUE : Un rapport A260/A280 de 1,8-2,1 est indicatif d’un ARNm hautement purifié.
3. Vérifiez la présence d’un seul produit, la longueur correcte du transcrit et la présence de résidus poly(A) en analysant les aliquotes des étapes 2.5 et 2.7 par électrophorèse sur gel d’agarose dans des conditions de dénaturation (par exemple, utilisez un gel d’agarose à 1,2 % contenant 20 mM d’acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique [MOPS], 5 mM d’acétate de sodium, 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 20 % de formaldéhyde et passez dans 20 mM de MOPS, 5 mM d’acétate de sodium, 1 mM d’EDTA et 0,74 % de formaldéhyde à courant constant de 100 V).
4. Conservez l’ARNm purifié dans le tube d’élution à -80 °C jusqu’à la transfection. Si vous n’utilisez que de faibles quantités d’ARNm pour la transfection, aliquote l’ARNm pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.
   REMARQUE : L’ARNm peut être conservé à -80 °C pendant environ 1 an.

4. Préparation des macrophages

1. Euthanasier des souris C57/BL6 (utiliser des souris du même sexe âgées de 6 à 24 semaines) par luxation cervicale.
   REMARQUE : Les mêmes souris peuvent être utilisées pour l’isolement des macrophages primaires (MP) (étape 4.2) et la génération de BMDM (étapes 4.3 et 4.4). Pour l’isolement des particules, utilisez au moins deux souris. Si seule la BMDM doit être générée, une seule souris suffit.
2. Enrichissement immunomagnétique des macrophages péritonéaux.
   1. Remplissez une seringue de 10 ml avec une canule de 0,9 x 40 mm avec 8 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée et 2 ml d’air. Rincer la cavité péritonéale avec du PBS. L’air formera une bulle qui minimisera les fuites du PBS.
   2. Prélever rapidement le lavage péritonéal avec la même seringue et le transférer dans un tube de centrifugation conique de 50 ml. Combinez les cellules péritonéales de plusieurs souris si nécessaire. Garder la suspension cellulaire sur la glace.
   3. Centrifuger la suspension cellulaire à 650 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de NaCl à 0,2 % pendant 30 s pour lyser les globules rouges.
   4. Ajouter 5 mL de NaCl à 1,6 % à un volume total de 10 mL pour reconstituer les conditions isotoniques. Centrifugeuse à 650 x g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 97,5 μL de tampon de tri cellulaire magnétique (MCS) (2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA], 0,5 % d’albumine sérique bovine [BSA] dans le PBS) par 1 lavage péritonéal (p. ex., si trois souris ont été rincées, remettre en suspension dans 292,5 μL).
   6. Ajouter 2,5 μL de billes paramagnétiques conjuguées à un anticorps spécifique de CD11b par 97,5 μL de suspension cellulaire (p. ex. ajouter 7,5 μL à 292,5 μL).
   7. Incuber sur glace pendant 15 min à 150 tr/min sur un agitateur orbital.
   8. Centrifugez la suspension cellulaire à 650 x g pendant 5 min à 4 °C, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon MCS.
   9. Ajoutez 4 ml de tampon MCS pour un volume total de 5 ml et lavez les cellules en pipetant doucement de haut en bas trois fois.
   10. Répétez les étapes 4.2.8 et 4.2.9 deux fois de plus, pour un total de trois étapes de lavage.
   11. Pendant les étapes de lavage, placez une colonne LS dans un séparateur de cellules magnétiques (voir tableau des matériaux). Rincez la colonne avec 3 mL de MCS buffer.
       note: Évitez les bulles car elles pourraient obstruer la colonne.
   12. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon MCS. Ajoutez 3 ml de tampon MCS pour un volume total de 4 ml et mélangez en pipetant trois fois vers le haut et vers le bas.
   13. Transférez les 4 mL de suspension cellulaire sur la colonne LS rincée.
       REMARQUE : Encore une fois, évitez les bulles car elles pourraient obstruer la colonne.
   14. Attendez que le réservoir de la colonne soit complètement vide. N’ajoutez pas de liquide supplémentaire tant que la colonne n’a pas cessé de couler.
   15. Ajoutez 3 ml de tampon MCS à la colonne. Ensuite, attendez que le réservoir de la colonne soit complètement vide. Répétez l’étape 4.2.15 deux fois de plus.
   16. Placez la colonne LS dans un tube de centrifugation conique de 15 ml. Appliquez 5 ml de tampon MCS sur la colonne. Attendez que 2 ml de liquide aient traversé la colonne, puis utilisez le piston pour pousser doucement la fraction restante dans le tube.
   17. Suspension de la cellule de centrifugation à 650 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   18. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum de veau fœtal (SCF) inactivé par la chaleur (DMEM+FCS).
   19. Déterminez le nombre de cellules viables en comptant dans une solution de bleu de trypan dans une chambre de comptage Neubauer et en ensemenceant des cellules dans DMEM+FCS dans des plaques de culture.
       REMARQUE : Semez les particules à une densité de 100 000 cellules/puits dans une plaque de microtitration à fond plat. N’utilisez pas de plaques traitées pour la culture tissulaire, car les particules ne peuvent pas être détachées de celles-ci. Utilisez plutôt des plaques non traitées.
3. Génération de BMDM
   1. Retirez la peau et les muscles des pattes arrière à l’aide d’une paire de ciseaux. Lavez chaque cuisse par immersion courte dans de l’éthanol à 70 %.
   2. Détachez les pattes et ouvrez les deux extrémités du fémur et du tibia en coupant avec des ciseaux.
   3. Remplissez une seringue de 5 mL remplie d’une canule de 0,6 mm x 30 mm avec 5 mL de RPMI 1640 à très faible teneur en endotoxines (ELV) et rincez la moelle osseuse des os ouverts dans une boîte de culture.
   4. Combinez la moelle osseuse de plusieurs souris si nécessaire en répétant les étapes 4.3.1 à 4.3.3. Transférez la moelle osseuse dans un tube de centrifugation conique de 50 ml.
   5. Centrifuger la suspension de moelle osseuse à 650 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   6. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (chlorure d’ammonium à 8,3 %, NH₄Cl, 0,1 M Tris) et incuber pendant 5 min à la RT pour lyser les globules rouges.
   7. Centrifuger la suspension cellulaire à 650 x g à 4° C pendant 5 min et jeter le surnageant.
   8. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complété par 10 % de FCS, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % d’HEPES, 1 % de pyruvate de sodium et 10 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages recombinants (M-CSF) (RPMI+++++).
   9. Ajouter 4 mL de RPMI+++++ à un volume total de 5 mL.
   10. Préparez 5 boîtes de Pétri non traitées de 92 mm x 16 mm avec des cames (voir le tableau des matériaux) par souris en pipetant 7 ml de milieu RPMI+++++ dans chaque boîte.
   11. Transvaser 1 mL de solution cellulaire dans les 5 boîtes de culture préparées et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂.
   12. Après 4 jours, nourrissez les cellules en ajoutant 4 ml de RPMI+++++. Après 6 à 7 jours, les cellules de la moelle osseuse sont complètement différenciées en BMDM.
4. Récolte de la BMDM
   1. Retirez complètement le milieu des boîtes de culture. Ajouter 5 ml d’EDTA tiède de 0,2 mM dans du PBS dans chaque plat.
   2. Grattez doucement toute la plaque avec un grattoir à cellules pour détacher le BMDM. Combinez les suspensions de cellules dans un tube de centrifugation conique de 50 ml.
   3. Rincez à nouveau les 5 plats. Utilisez le même volume de 5 ml d’EDTA chaud de 0,2 mM dans du PBS pour les 5 plats. Combinez cette suspension cellulaire avec celle de l’étape précédente.
   4. Centrifuger la suspension cellulaire à 650 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   5. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu VLE RPMI 1640 complété par 10 % de FCS, 1 % d’HEPES, 1 % de pyruvate de sodium et 10 ng/mL de M-CSF recombinant, mais sans antibiotiques (RPMI^++++).
   6. Déterminez le nombre de cellules viables en comptant dans une solution de bleu de trypan dans une chambre de comptage de Neubauer et des cellules de semence dans RPMI⁺⁺⁺⁺ dans des plaques de culture.
      note: Grainez la BMDM à une densité de 50 000 cellules/puits maximum dans une plaque de microtitration à fond plat. N’utilisez pas de plaques traitées pour la culture tissulaire car la DMO peut difficilement se détacher de celles-ci. Utilisez plutôt des plaques non traitées.

5. Transfection de macrophages avec de l’ARNm

1. Calculez le volume requis de tampon de transfection de l’ARNm.
   note: Le volume de tampon de transfection de l’ARNm requis dépend de la taille du puits : utilisez 200 μL pour la transfection dans une plaque à 6 puits, 100 μL dans une plaque à 12 puits, etc. Ajoutez toujours un peu de volume de rechange en raison de la perte de pipetage (mais pas trop, pour éviter une dilution excessive de l’ARNm). Par exemple, utilisez 450 μL au lieu de 4 x 100 μL = 400 μL pour transfecter dans 4 puits d’une plaque de 12 puits.
2. Calculez le volume requis de réactif de transfection de l’ARNm. Le réactif de transfection de l’ARNm est ajouté dans un rapport de 1:50. Par exemple, 9 μL de réactif de transfection de l’ARNm sont nécessaires pour un volume final de 450 μL.
3. Calculez la quantité totale d’ARNm requise. Au moins 100 ng pour 100 000 macrophages sont nécessaires pour une transfection efficace, 200 ng fonctionnent encore mieux (par exemple, 800 ng d’ARNm pour transfecter 400 000 macrophages).
   1. Multipliez la quantité calculée d’ARNm requise par le nombre total de puits à transfecter (p. ex., 4 puits de 400 000 macrophages chacun : 4 x 800 ng = 3 200 ng d’ARNm sont nécessaires au total pour tous les puits). Par exemple, si votre stock d’ARNm est de 426,8 ng/μL, 7,49 μL sont nécessaires pour une transfection optimale de 4 puits de 400 000 macrophages chacun.
4. Ajoutez le volume calculé du tampon de transfection de l’ARNm (étape 5.1) moins les volumes du réactif de transfection de l’ARNm (étape 5.2) et de l’ARNm (étape 5.3) dans un tube de réaction. Par exemple, 450 μL - 9 μL - 7,49 μL = 433,51 μL.
5. Décongelez le stock d’ARNm et mélangez-le en retournant doucement le tube d’élution. Ajoutez le volume calculé d’ARNm (étape 5.3) dans le tube réactionnel avec le tampon de réaction de l’ARNm (dans l’exemple présenté ci-dessus : 7,49 μL dans 433,51 μL).
6. Vortex pendant 5 s et rotation descendante pendant 2 s à 2 000 x g.
7. Vortex le réactif de transfection de l’ARNm pendant 5 s et spin down pendant 2 s à 2 000 x g.
8. Ajouter le volume calculé de réactif de transfection de l’ARNm (étape 5.2) dans le tube réactionnel contenant le tampon de transfection de l’ARNm et l’ARNm (dans l’exemple présenté ci-dessus : 9 μL de réactif de transfection de l’ARNm).
9. Vortex la transfection mélange pendant 5 s et tourne vers le bas pendant 2 s à 2 000 x g.
10. Incuber pendant 15 min à RT.
11. Entre-temps, remplacez le milieu de culture des macrophages par un milieu de culture frais et chaud (voir étapes 4.2.18 et 4.4.5).
12. Après l’étape d’incubation 5.10, ajouter le mélange de transfection dans les puits contenant les macrophages dans un volume adapté à la taille du puits (voir étape 5.1). Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte en cercle de l’extérieur vers le milieu du puits.
13. Basculez doucement la plaque, d’abord dans le sens vertical, puis dans le sens horizontal pour assurer une répartition uniforme du mélange de transfection dans le puits. Ensuite, incuber à 37 °C et 5 % CO₂. La synthèse de la protéine codée par l’ARNm transfecté commencera peu de temps après la transfection. Pour de meilleurs résultats, incuber pendant au moins 6 h.
14. Après l’incubation, analysez l’efficacité de la transfection par microscopie (immuno)fluorescence, cytométrie en flux ou immunoblot, ou utilisez les macrophages transfectés pour l’expérience de votre choix.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-méthyl-CTP (100 mM)	Biosience d’Iéna	NU-1138S	stocké à -20 °C
Phosphatase antarctique	BioLabs de la Nouvelle-Angleterre	Référence M0289	stocké à -20 °C
Tampon de réaction de la phosphatase de l’Antarctique (10X)	BioLabs de la Nouvelle-Angleterre	Réf. B0289	stocké à -20 °C
anticorps anti-NEMO/IKKγ	Invitrogen	Référence : MA1-41046	stocké à -20 °C
Anticorps anti-β-actine	Sigma-Aldrich	A2228	stocké à -20 °C
Boîtes de Pétri 92,16 mm avec cames	Sarstedt	8 21 473	stocké chez RT
CD11b Microbilles souris et homme	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-049-601	stocké à 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor primaire avant	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3', stocké à -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor amorce inverse	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stocké à -20 °C
Kit de purification de l’ADN : Kit de purification PCR QIAquick	Qiagen	Référence 28104	stocké chez RT
Amorce avant eGFP + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5'-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGG AGCAAGG-3', stocké à -20 °C
Amorce inversée eGFP + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5'-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3', stocké à -20 °C
Tampon Fast Digest (10X)	Thermo Scientific	B64	stocké à -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	Réf. FD0684	stocké à -20 °C
Polymérase haute fidélité avec relecture : Q5 DNA-polymérase haute fidélité	Nouvelle-Angleterre Biolabs Inc	M0491S	stocké à -20 °C
IKKβ + T7-Promotor amorce	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stocké à -20 °C
IKKβ + T7-Promotor amorce inverse	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stocké à -20 °C
kit de transcription d’ARNm in vitro : kit d’ARNm HiScribe T7 ARCA (avec queue polyA)	BioLabs de la Nouvelle-Angleterre	E2060	stocké à -20 °C
Colonnes LS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-401	stocké chez RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-303	stocké chez RT
tampon et réactif de transfection de l’ARNm : jetMESSENGER	Transfection Polyplus	409-0001DE	stocké à 4 °C
Plasmide mutant IKKβ IKK-2S177/181E	Addgene	Référence 11105	stocké à -20 °C
Plasmide mutant NEMOC54/347A	Addgene	Référence 27268	stocké à -20 °C
Plasmide pEGFP-N3	Addgene	Référence 62043	stocké à -20 °C
Poly(I :C)	Calbiochimie	528906	stocké à -20 °C
Plasmide pPGK-Cre			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nouveaux variants de la recombinase Cre inductible : un nouveau mutant de la protéine de fusion Cre-PR présente une sensibilité accrue et une gamme élargie d’inductibilité. Acides nucléiques Res. 29, 47e (2001). stocké à -20 °C
Pseudo-UTP (100 mM)	Biosience d’Iéna	NU-1139S	stocké à -20 °C
Séparateur QuadroMACS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-090-976	stocké chez RT
Anticorps CD11b anti-souris de rat, conjugué APC	BioLégende	101212	stocké à 4 °C
Anticorps F4/80 anti-souris, conjugué au PE	eBiosciences	Référence 12-4801-82	stocké à 4 °C
M-CSF recombinant	Peprotech	Référence 315-02	stocké à -20 °C
Kit de purification de l’ARN : Kit de nettoyage de la transcription MEGAclear	ThermoFisher Scientific	AM1908	stocké à 4 °C
Tensioactif dégradant l’ARNASE : RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	stocké chez RT
LPS ultra-pur d’E.coli O111 :B4	Invivogen		stocké à -20 °C
Plasmide IKKβ de type sauvage	Addgene	Référence 11103	stocké à -20 °C
Plasmide NEMO de type sauvage	Addgene	Référence 27268	stocké à -20 °C