Transfection de macrophages primaires avec de l’ARNm modifié

Résumé

Source : Herb, M. et al., Transfection hautement efficace de macrophages primaires avec de l’ARNm transcrit in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre le processus de transfection de macrophages primaires avec un ARNm modifié codant pour une protéine fluorescente verte. Ces ARNm modifiés, conçus pour réduire l’immunogénicité et améliorer sa stabilité, assurent la transfection réussie et l’expression ultérieure des protéines fluorescentes vertes, ce qui est confirmé par la microscopie à fluorescence.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes avec des gants. Effectuez toutes les étapes de transfection sous une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination des cellules. Avant de travailler avec de l’ARNm, nettoyez tous les instruments tels que les pipettes et toutes les surfaces avec de l’éthanol à 70 % et/ou un tensioactif dégradant l’ARNase (tableau des matériaux). Assurez-vous que tous les tubes de réaction sont exempts d’ARNASE e....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-méthyl-CTP (100 mM)	Biosience d’Iéna	NU-1138S	stocké à -20 °C
Phosphatase antarctique	BioLabs de la Nouvelle-Angleterre	Référence M0289	stocké à -20 °C
Tampon de réaction de la phosphatase de l’Antarctique (10X)	BioLabs de la Nouvelle-Angleterre	Réf. B0289	stocké à -20 °C
anticorps anti-NEMO/IKKγ	Invitrogen	Référence : MA1-41046	stocké à -20 °C
Anticorps anti-β-actine	Sigma-Aldrich	A2228	stocké à -20 °C
Boîtes de Pétri 92,16 mm avec cames	Sarstedt	8 21 473	stocké chez RT
CD11b Microbilles souris et homme	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-049-601	stocké à 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor primaire avant	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3', stocké à -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor amorce inverse	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stocké à -20 °C
Kit de purification de l’ADN : Kit de purification PCR QIAquick	Qiagen	Référence 28104	stocké chez RT
Amorce avant eGFP + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5'-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGG AGCAAGG-3', stocké à -20 °C
Amorce inversée eGFP + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5'-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3', stocké à -20 °C
Tampon Fast Digest (10X)	Thermo Scientific	B64	stocké à -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	Réf. FD0684	stocké à -20 °C
Polymérase haute fidélité avec relecture : Q5 DNA-polymérase haute fidélité	Nouvelle-Angleterre Biolabs Inc	M0491S	stocké à -20 °C
IKKβ + T7-Promotor amorce	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stocké à -20 °C
IKKβ + T7-Promotor amorce inverse	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stocké à -20 °C
kit de transcription d’ARNm in vitro : kit d’ARNm HiScribe T7 ARCA (avec queue polyA)	BioLabs de la Nouvelle-Angleterre	E2060	stocké à -20 °C
Colonnes LS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-401	stocké chez RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-303	stocké chez RT
tampon et réactif de transfection de l’ARNm : jetMESSENGER	Transfection Polyplus	409-0001DE	stocké à 4 °C
Plasmide mutant IKKβ IKK-2S177/181E	Addgene	Référence 11105	stocké à -20 °C
Plasmide mutant NEMOC54/347A	Addgene	Référence 27268	stocké à -20 °C
Plasmide pEGFP-N3	Addgene	Référence 62043	stocké à -20 °C
Poly(I :C)	Calbiochimie	528906	stocké à -20 °C
Plasmide pPGK-Cre			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nouveaux variants de la recombinase Cre inductible : un nouveau mutant de la protéine de fusion Cre-PR présente une sensibilité accrue et une gamme élargie d’inductibilité. Acides nucléiques Res. 29, 47e (2001). stocké à -20 °C
Pseudo-UTP (100 mM)	Biosience d’Iéna	NU-1139S	stocké à -20 °C
Séparateur QuadroMACS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-090-976	stocké chez RT
Anticorps CD11b anti-souris de rat, conjugué APC	BioLégende	101212	stocké à 4 °C
Anticorps F4/80 anti-souris, conjugué au PE	eBiosciences	Référence 12-4801-82	stocké à 4 °C
M-CSF recombinant	Peprotech	Référence 315-02	stocké à -20 °C
Kit de purification de l’ARN : Kit de nettoyage de la transcription MEGAclear	ThermoFisher Scientific	AM1908	stocké à 4 °C
Tensioactif dégradant l’ARNASE : RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	stocké chez RT
LPS ultra-pur d’E.coli O111 :B4	Invivogen		stocké à -20 °C
Plasmide IKKβ de type sauvage	Addgene	Référence 11103	stocké à -20 °C
Plasmide NEMO de type sauvage	Addgene	Référence 27268	stocké à -20 °C