REMARQUE : Le protocole suivant décrit les étapes nécessaires pour éliminer des cellules spécifiques à l’aide de la photoimmunothérapie proche infrarouge (NIR-PIT). Des contrôles et d’autres détails sur le NIR-PIT et la viabilité cellulaire peuvent être trouvés ailleurs.
1. Conjugaison de l’infrarouge 700 (IR700) en anticorps monoclonaux (mAb)
- Préparer l’AcM d’intérêt à raison de 2 à 5 mg/ml dans une solution d’hydrogénophosphate disodique 0,1 M (Na2, HPO4) (pH 8,6).
- Mélangez 6,8 nmol de mAb avec 30,8 nmol de 10 mM IR700 dans une solution de 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6) dans un tube de microcentrifugation et incubez à RT pendant 1 heure, recouvert d’une feuille d’aluminium.
- Lavez deux fois la colonne PD-10 (voir le tableau des matériaux/équipements) avec 15 ml de PBS. Chargez l’échantillon à partir de l’étape 1.2.
- Purifier le mélange via la colonne PD-10 par élution PBS selon les instructions du fabricant.
REMARQUE : Ici, l’élution s’est faite le long de la couleur de la bande IR700. Pour un échantillon de 300 μl, la fraction d’élution PBS est généralement comprise entre 2,5 ml et 4,4 ml.
- Déterminez la concentration en protéines avec la coloration Coomassie en mesurant l’absorption à 595 nm avec un spectrophotomètre. Déterminer la concentration d’IR700 avec absorption à 689 nm pour confirmer le nombre de molécules fluorophores conjuguées à chaque molécule d’AcM.
REMARQUE : Il est important de déterminer un nombre optimal de conjugaison des molécules IR700 dans 1 mAb à l’aide d’un spectrophotomètre. En général, environ 3 molécules IR700 dans 1 molécule d’AcM sont optimales pour les travaux in vitro et in vivo. Les méthodes de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) peuvent être utilisées pour confirmer si l’AcM et l’IR700 sont liés ou non.
- Conserver à 4 °C après avoir déterminé la concentration en protéines.
2. Préparation de la culture cellulaire 3D mixte (sphéroïde mixte)
- Appliquez de l’eau stérile (environ 1 ml) dans la section du réservoir de la plaque des plaques de chute suspendues.
- Préparez divers rapports des types de cellules d’intérêt (cellules A431-protéine fluorescente verte luciférase (A431-luc-GFP) et cellules 3T3-protéine fluorescente rouge (3T3-RFP), chaque échantillon contenant 5 000 cellules au total, en suspension dans 50 μl de milieu de culture.
REMARQUE : Préparez des rapports de types de cellules d’intérêt de 1:100, 10:100, 25:100, 50:100, etc. dans les milieux de culture en fonction du type de cellule.
- Incuber le mélange pendant 5 à 7 jours dans la plaque de chute suspendue à 96 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone. Changez le milieu de culture tous les 2 jours. REMARQUE : Pour fabriquer le sphéroïde 3D avec précision, manipulez la plaque avec douceur, car les gouttes contenant des cellules tombent facilement avant de former des formes 3D.
- Observez la morphologie et la taille des sphéroïdes à l’aide d’un microscope à fond clair inversé à un grossissement de 10X à 40X. REMARQUE : Bien que cela dépende des types de cellules et de la taille de la goutte suspendue, assurez-vous que le diamètre du sphéroïde est d’environ 400-600 μm après 7 jours d’incubation dans la plaque de chute suspendue à 96 puits.
3. NIR-PIT in vitro pour la culture cellulaire mixte 3D
- Remplacer le milieu des plaques de chute suspendues par un milieu contenant un conjugué anticorps-photoabsorbeur (APC) de 10 μg/ml et incuber pendant 6 heures dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone.
- Après 6 heures d’incubation, laver le sphéroïde deux fois avec un milieu de culture frais (sans rouge de phénol). Transférez délicatement le sphéroïde dans une boîte à fond de verre de 50 mm avec 100 μl de milieu de culture frais sans rouge de phénol à l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 μl avec la pointe coupée. Placez un sphéroïde dans chaque plat.
- Observez le sphéroïde à l’aide d’un microscope à fond clair inversé pour détecter le changement de morphologie. Pour observer les rapporteurs optiques (par exemple, GFP et RFP), utilisez un microscope à fluorescence avec les réglages de filtre suivants : GFP — filtre d’excitation de 469 nm et filtre d’émission de 525 nm ; RFP — Filtre d’excitation de 559 nm et filtre d’émission de 630 nm.
- Placez la diode électroluminescente (LED) au-dessus de la parabole à fond de verre pour l’irradiation.
REMARQUE : Les sphéroïdes peuvent être exposés à la lumière NIR soit sur le microscope, soit dans le capuchon laminaire.
- Mesurez la densité de puissance de la lumière NIR à l’aide d’un wattmètre optique. Selon cette mesure, irradier la lumière proche infrarouge via des diodes électroluminescentes (LED) qui émettent de la lumière à des longueurs d’onde de 670 à 710 nm à 2 J/cm2.
REMARQUE : La lumière LED peut pénétrer une profondeur maximale d’environ 5 pouces. Les effets cytotoxiques du NIR-PIT ne dépendent que de l’énergie donnée, indépendamment de la densité de puissance et de la durée de l’exposition.
- Après l’irradiation, transvaser le sphéroïde dans une nouvelle plaque de chute suspendue avec 50 μl de milieu de culture frais et incuber pendant 1 jour dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone.
- Transférez délicatement le sphéroïde dans une boîte à fond de verre avec 100 μl de milieu de culture frais (sans rouge de phénol) à l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 μl avec l’extrémité coupée. Observez le sphéroïde avec un microscope à fluorescence 1 jour après NIR-PIT en utilisant les paramètres de filtre décrits à l’étape 3.3.
- Détecter les cellules mortes en ajoutant de l’iodure de propidium dans le milieu à une concentration finale de 2 μg/ml, ou en perdant la fluorescence cytoplasmique de la GFP à l’aide d’un microscope à fluorescence (Figure 1B).
- Répétez les étapes 3.1 à 3.6 si les cellules cibles ne sont pas complètement éliminées.
