Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut. Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Génération de souris HIS
- Elevage de souris de souris BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) souris
note: Cette souche est extrêmement immunodéficiente, sans cellules T, B ou tueuses naturelles (NK). Par conséquent, des mesures rigoureuses doivent être utilisées pour prévenir les infections opportunistes. Maintenir la colonie avec un régime contenant du triméthoprime et de la sulfadiazine en alternance de 2 semaines avec un régime normal. Maintenir le logement avec le plus de précautions possible (p. ex., une salle de douche barrière à accès limité).
- Maintenir des colonies de souris homozygotes BALB/c -Rag2null, Il2RγCnull, SirpαNOD (BRGS) et BALB/c Rag2null, Il2RγCnull, Sirpa,Balb/c (BRG) en tant que reproducteurs.
- Élevez des bébés BRGSN/N×BRGB/B pour générer des petits BRGSB/N, qui seront utilisés comme receveurs de cellules souches humaines. Dans cette colonie, les BRGSB/N sont plus sains que les BRGSN/N, et se greffent à des niveaux équivalents (plus que les BRG).
- Isolement de cellules souches humaines CD34+ à partir de sang de cordon ombilical (CB)
note: Aucun antibiotique n’est utilisé pour cette procédure. Par conséquent, une bonne technique stérile est impérative.
- Placez un support de tube conique de 50 ml, ainsi que 3 tubes coniques de 15 ml et ~10 tubes coniques de 50 ml dans une enceinte de biosécurité stérilisée (ESB). Vaporisez un sac de prélèvement sanguin avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le sécher dans le BSC.
- Calculer le nombre de tubes coniques de 50 mL requis pour l’isolation du gradient de densité CB = volume CB/15, arrondi à la hausse et au nombre pair de tubes. Calculer volume sanguin par tube = volume CB/nombre de tubes. Versez soigneusement le sang du sac CB dans chaque tube conique ; il s’agit d’un maximum de 15 ml par tube. À l’aide d’une pipette automatique et d’une pipette sérologique de 25 mL, mélangez le sang 1:1 avec du PBS stérile en pipetant de haut en bas.
- À l’aide d’une pipette automatique à basse vitesse et d’une pipette sérologique de 10 mL, sous-couche lentement le sang avec une solution de gradient de densité de 1,077 g/mL à température ambiante (voir le tableau des matériaux) sans perturber l’interface. Empêchez la pointe de la pipette de toucher le fond du tube. Répétez l’opération pour tous les tubes. Puis centrifuger pendant 30 min à 850 x g, sans freinage, à RT pour assurer le maintien du gradient de densité.
- Visualisez la couche leucocytaire cellulaire au-dessus du gradient de densité de 1,077 g/mL sous la forme d’une couche blanche trouble. Retirer et jeter la couche de plasma jusqu’à environ 10 mL au-dessus de la couche leucocytaire à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL et d’un pipetteur automatique.
- Prélever la couche leucocytaire à l’aide d’une pipette de transfert stérile ou d’une pipette sérologique. Utilisez la pipette comme une spatule pour gratter les cellules sur le côté du tube conique tout en relâchant le bulbe (ou en pipetant lentement) pour tirer les cellules vers le haut. Combinez les couches leucocytaires de deux tubes coniques de 50 ml dans un nouveau tube conique de 50 ml.
- Lavez les cellules en versant 45 ml de solution saline équilibrée de Hanks stérile contenant 2 % de sérum fœtal bovin (FBS) dans chaque tube conique. Centrifugeuse pendant 11 min à 360 x g à RT.
- Dans tous les tubes, aspirez le produit de lavage jusqu’à la pastille. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL et d’une pipette automatique, la première pastille est remise en suspension dans 10 mL de HBSS contenant 2 % de FBS. Remettez chaque pastille en suspension dans les mêmes 10 ml de HBSS et rincez chaque tube avec 10 ml supplémentaires de HBSS pour rassembler toutes les cellules dans un seul tube.
- Verser 45 mL de HBSS stérile contenant 2 % de FBS dans le tube conique. Centrifugeuse pendant 10 min à 360 x g, à 4 °C.
- Aspirez le tampon de lavage jusqu’à la pastille de cellule et remettez la pastille en suspension dans 20 ml de tampon de séparateur de cellule magnétique (voir le tableau des matériaux). Prélever une petite aliquote pour compter les cellules à l’aide d’un hémacytomètre à une dilution de 1:20 dans le bleu de méthylène. Ajoutez le nombre de cellules bleues et blanches. Centrifugeuse à 360 x g, pendant 10 min à 4 °C.
note: Ce protocole utilise la technologie des billes magnétiques (voir le tableau des matériaux). Le protocole peut être modifié pour être utilisé avec n’importe quelle technologie de séparation cellulaire, avec une pureté et un rendement suffisants des cellules souches CD34+.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellules CD34+ isolée du sang de cordon dans 300 μL de tampon séparateur de cellules magnétiques par 1 x 108 cellules. Ajoutez d’abord 100 μL de réactif bloquant le récepteur Fc (FcR), puis 100 μL de billes magnétiques CD34+ par 1 x 108 cellules. Incuber à 4 °C pendant 30 min (pas de glace).
- Ajouter 5 mL de tampon séparateur de cellules magnétiques par 1 x 108 cellules et faire tourner à 360 x g pendant 10 min à 4 °C. Répéter l’étape de lavage et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon de séparateur de cellules magnétiques par 1 x 108 cellules dans un tube conique de 15 mL étiqueté « non fractionné ».
- Étiquetez deux autres tubes coniques de 15 mL « CD34- » et « CD34+ ». Placez les trois tubes coniques de 15 ml (non fractionnés, CD34- et CD34+) dans les fentes A1, B1 et C1, respectivement, sur une grille de refroidissement (voir le tableau des matériaux). Séparez les cellules à l'aide du programme de sélection positive à deux colonnes sur un séparateur automatique de cellules magnétiques (voir le tableau des matériaux) dans une ESB, conformément aux instructions de l'instrument du fabricant.
- Expansion et congélation des cellules souches humaines CD34+
- Aliquote 10 μL de la suspension de cellules CD34+ récupérée (2 mL) sur une lame d’hémocytomètre et compter les cellules sous un grossissement de 10x. Calculez le nombre total de cellules CD34+ en multipliant le nombre de cellules par 2 x 104. Divisez le nombre total de cellules CD34+ par 250 000 pour calculer le nombre de fioles à congeler (50 000 cellules par bébé de souris avant l’expansion in vitro).
- Préparez le sérum de veau fœtal (FCS) à 10 % d'Iscove (plus 1 mL supplémentaire pour filtrer la perte), complété par 40 ng/mL de facteur de cellules souches, 20 ng/mL de tyrosine kinase 3 de type FMS (Flt3L) et 10 ng/mL d'interleukine-6 (IL-6), et passez à travers un filtre de 0,22 μm. Remettre les cellules CD34+ en suspension à 100 000 par mL de milieu CB et incuber à 37 °C. Le jour 3, ajouter un volume équivalent de milieu CB sans cytokines dans le ballon contenant les cellules et le milieu CB avec cytokines.
note: L’ajout de ces cytokines au milieu CB favorise la survie et l’expansion des cellules CD34+ tout en empêchant la différenciation.
- Récoltez les cellules CD34+ élargies le jour 5. Pipeter la suspension cellulaire de haut en bas et recueillir dans un tube conique de 50 ml. Ajouter suffisamment de milieu CB pour couvrir le fond de la fiole. À l’aide d’un grattoir à cellules, racler tout le fond de la fiole. Recueillir tous les milieux dans le même tube de 50 mL et centrifuger à 360 x g pendant 11 min.
- Remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu CB. Conservez la dernière goutte de la pipette dans une plaque de 96 puits pour le comptage. Diluez les cellules 1:1 dans du bleu trypan et ajoutez 10 μL à l’hémacytomètre, puis comptez et mesurez les cellules de quatre quadrants. Calculez le nombre total de cellules CD34+ en multipliant le nombre de cellules par 4 x 104, et notez la viabilité.
- Produire n+1 mL de produit de congélation, où n est le nombre de flacons de congélation calculé à l’étape 1.3.1. Préparez le fluide de congélation en ajoutant 10 % (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO) au FBS et conservez sur de la glace. Étiquetez les flacons cryogéniques avec CB#, CD34+ d5 et la date.
- Faites tourner les cellules CD34+ à 360 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirez le fluide jusqu’à la pastille et remettez la pastille en suspension dans le produit de congélation. Déposer 1 mL de suspension cellulaire dans chaque flacon et répartir le reste également entre les flacons. Ajouter les flacons dans un congélateur à cellule d’isopropanol refroidi à 4 °C, placer à -80 °C et transférer dans de l’azote liquide pour les conserver pendant >90 jours.
- Irradiation des petits souris
- Rassemblez les petits BRGSB/N, 1 à 3 jours après la naissance, dans une boîte en plastique autoclavée avec rembourrage. Ajoutez une petite quantité de litière avec les chiots. Étiquetez la boîte avec le numéro de la cage et le nombre de chiots.
- Installez l’irradiateur (voir tableau des matériaux) pour une dose de 300 rad. Placez la boîte de chiots dans l’irradiateur et exposez-les à 300 rad. Ramenez les chiots dans leur cage, placez-les en tas et couvrez-les de litière.
- Injections de petits et préparation de cellules CD34+
- Commencer la préparation des cellules CD34+ ~3 h après l’irradiation. Réchauffer 10 mL de média CB dans un tube conique de 50 mL. Effectuez toutes les étapes dans un BSC stérile.
- Récupérer un flacon de cellules CD34+ expansées et congelées in vitro pour quatre à six petits à injecter. Décongeler rapidement à 55 °C, jusqu’à ce qu’une petite quantité de glace soit visible, et ajouter les cellules au milieu CB réchauffé (le flacon doit être encore froid au toucher). Rincer chaque flacon à l’aide de 1 mL de fluide et faire tourner les cellules à 360 x g pendant 12 min à 4 °C
REMARQUE : La décongélation rapide à 55 °C a permis d’obtenir une meilleure viabilité cellulaire (90 % à 95 %) que la décongélation à 37 °C.
- Aspirez le fluide avec précaution. Remettre la (petite) pastille en suspension dans 2 mL de milieu CB, mélanger doucement et ajouter ~30 μL de suspension cellulaire dans un seul puits dans une plaque de comptage. Diluez 1:1 dans du bleu trypan, puis ajoutez 10 μL à un hémocytomètre et comptez et mesurez les cellules de quatre quadrants.
- Calculez le nombre total de cellules CD34+ en multipliant le nombre de cellules par 4 x 104, puis notez la viabilité. Essorage à 360 x g pendant 12 min à 4 °C.
- Aspirez le milieu avec précaution et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de PBS stérile par chiots n+1 à injecter, ce qui donne 250 000 à 450 000 cellules CD34+ par souris. Placez le tube conique sur de la glace dans un récipient de transport et rendez-vous au vivarium pour l’injection du chiot.
- Apportez une lampe chauffante, des couches, une seringue de 1 ml, une aiguille de 18 g, une aiguille de 30 g et la préparation de cellules CD34+ dans des contenants stériles au vivarium BSC. Placez une couche stérile à ~2 pieds sous la lampe chauffante. Récupérez la cage avec la litière à injecter et placez-la dans l’ESB.
- Assemblez la seringue à l’aide d’une aiguille biseautée de 18 G. En adaptant l’angle du tube conique avec le biseau de l’aiguille, mélangez doucement et tirez la suspension cellulaire. Placez les chiots sur la couche pour les réchauffer (attention à la surchauffe). Retirez l’air de la seringue et remplacez l’aiguille de 18 G par l’aiguille de 30 G, puis poussez délicatement la seringue jusqu’à ce que la suspension cellulaire se trouve juste à l’extrémité de l’aiguille.
note: Alternativement, une seringue à insuline peut être utilisée.
- Emmenez un chiot à la fois jusqu’au bord de la couche, loin de la lampe chauffante. Immobilisez le chiot sur le côté sous le pouce et l’index, ce qui permet de voir clairement le visage. Remarquez la veine à travers la joue sous l’endroit où se trouvera l’oreille. Insérez l’aiguille peu profondément dans la veine (IV) la plus proche de l’œil et injectez lentement 50 μL de cellules.
- Vérifiez si une bulle se forme à partir d’une injection sous-cutanée. Si c’est le cas, insérez l’aiguille plus profondément et procédez à l’injection des cellules. Une petite goutte de sang/hématome sera visible en cas de succès.
- Avec le petit toujours immobilisé, effectuez une injection intrahépatique (IH) avec 50 μL supplémentaires de cellules (100 μL au total par petit de IV+IH). Le foie peut être visualisé comme une tache sombre entre la bande de lait blanche et la cage thoracique. Placez le chiot injecté sur une couche plus éloignée des chiots non injectés et chauffez-le.
note: L’injection IV entraîne un meilleur chimérisme à long terme que l’injection d’IH seule, mais les injections IV ne sont pas toujours efficaces. Par conséquent, la division de l’injection entre IV et IH assure la greffe dans un plus grand pourcentage de souris.
- Répétez les injections dans les veines faciales et l’IH pour tous les chiots. Nettoyez tout sang, remettez les chiots dans le nid dans leur cage et couvrez-les de litière.
