Une thérapie adjuvante dans un modèle murin avec une tumeur sous-cutanée incomplètement réséquée

Résumé

Source : Rwandamuriye, F. X. et al., A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies.J. Vis. Exp.(2020)

Cette vidéo illustre l’essai d’un traitement adjuvant ou supplémentaire dans un modèle murin avec des tumeurs sous-cutanées incomplètement réséquées. La souris partiellement réséquée est traitée avec un anticorps ciblant la protéine anti-cytotoxique des cellules T régulatrices, réduisant potentiellement la repousse tumorale et suggérant un traitement adjuvant efficace.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Inoculation des cellules

1. Préparation de cellules et d’animaux
   1. Assurez-vous que la lignée cellulaire est maintenue dans le milieu recommandé. Par exemple, conservez la lignée cellulaire WEHI 164 dans un milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complétée par 2 mM de L-glutamine, 10 % de sérum de veau fœtal, 20 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
      note: Cellules de passage au moins 3 et jusqu’à 5 fois après avoir été retirées du stockage cryogénique. Pour assurer une viabilité cellulaire optimale, les cellules doivent être divisées lorsqu’elles sont confluentes entre 70 et 80 %. Les lignées cellulaires tumorales doivent être testées pour les mycoplasmes, car l’infection peut modifier la croissance cellulaire et influencer la réponse immunitaire in vivo.
   2. Un jour avant l’inoculation, rasez les souris sur le flanc inférieur droit à l’aide d’une tondeuse.
      note: Des souris femelles BALB/c, âgées de 8 à 12 semaines, de poids normal (16 à 22 grammes) ont été utilisées dans cette expérience.
   3. Le jour de l’inoculation, récolter les cellules de WEHI 164 lorsque 70 à 80 % sont confluents par trypsinisation.
      1. Aspirer le milieu de culture des flacons de culture tissulaire, puis ajouter une solution tamponnée au phosphate stérile (1x PBS), pour éliminer les traces restantes de sérum bovin fœtal (FBS).
      2. Aspirer le PBS des flacons de culture tissulaire. Ajouter 3 mL de trypsine à 0,05 % (pour une fiole T75), puis faire tourner la fiole de manière à ce que toute la surface de la fiole contenant des cellules soit recouverte de trypsine.
      3. Incuber le ballon à 37 °C, dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 3 min. Vérifiez les cellules périodiquement, en tapotant sur les côtés du ballon pour voir si les cellules se sont délogées.
      4. Retirer les flacons de l’incubateur de culture cellulaire et ajouter 5 mL de milieu complété par du FBS pour neutraliser la trypsine.
         note: Ne laissez pas les cellules dans la trypsine plus longtemps que nécessaire, car cela peut endommager les cellules et entraîner une faible viabilité cellulaire.
      5. Suspension à pipette plusieurs fois pour obtenir une suspension à cellule unique. Transfert de la suspension de la cellule dans un tube de centrifugation conique.
      6. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
   4. Lavez les cellules trois fois dans 1x PBS.
      1. Remettez les cellules en suspension dans 50 mL de PBS 1x stérile et lavez les cellules en pipetant la suspension cellulaire de haut en bas. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
      2. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 15 mL de PBS stérile. Laver les cellules en pipetant la suspension cellulaire de haut en bas. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
      3. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans exactement 10 ml de PBS 1x stérile. Laver les cellules comme à l’étape 1.1.4.2 et transférer une petite quantité (environ 100 μL) de suspension cellulaire dans un tube à centrifuger pour le comptage. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
   5. Déterminez le nombre de cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Remettre en suspension les cellules dans du PBS stérile 1x à une concentration de 5 x 10⁶ cellules/mL. Gardez la suspension cellulaire sur la glace.
      note: La viabilité des cellules tumorales doit être égale ou supérieure à 80 % pour assurer une croissance tumorale reproductible.
2. Inoculation sous-cutanée
   1. Mélangez soigneusement la suspension cellulaire et remplissez une seringue avec une aiguille de 26 G avec 100 μL de suspension cellulaire (5 x 10⁵ cellules) dans 1x PBS stérile. Répétez le mélange des cellules avant de charger la seringue suivante.
      note: Gardez les cellules sur de la glace tout au long de l’intervention pour maintenir la viabilité.
   2. Retenez la souris de manière appropriée, en assurant l’accès au flanc inférieur droit. Inoculer la souris par voie sous-cutanée sur le flanc inférieur droit rasé.
      note: Assurez-vous que l’inoculation n’est pas dans le péritoine en soulevant légèrement l’aiguille, qui doit être visible sous la peau. Une masse en forme de bulle devrait se former sous la peau après l’inoculation.
   3. Surveiller les souris comme l’exige l’approbation éthique applicable et effectuer une résection chirurgicale lorsque les tumeurs ont atteint une taille d’environ 50^mm2.

2. Résection chirurgicale partielle de la tumeur

NOTE : Ce protocole nécessite DEUX chercheurs ; un pour les procédures chirurgicales (SURGEON), et un autre pour le suivi des souris (ASSISTANT).

1. Configuration chirurgicale
   1. Le 12e jour après l’inoculation, lorsque les tumeurs ont atteint une taille d’environ 50^mm2, administrer à des souris 100 μL (0,1 mg/kg) de buprénorphine s.c. dans la peau du cou, 30 minutes avant la chirurgie.
   2. Installez la zone chirurgicale avec un coussin chauffant recouvert d’une blouse de banc et installez un cône nasal pour l’anesthésie. Stérilisez les outils chirurgicaux avant de les utiliser et entre chaque animal à l’aide d’un stérilisateur à billes de chaleur, en laissant les outils refroidir avant utilisation. Ayez le matériel chirurgical suivant propre et à portée de main : chlorhexidine, écouvillon, gaze, gel pour les yeux, deux pinces incurvées, ciseaux, applicateur de clip, extracteur de clip et recharges de clip (figures 1A, 1B).
   3. Réchauffez la chambre de chauffe à 37 °C et installez un autre coussin chauffant pour le récupérer (Figure 1C). Placez les outils stérilisés sur une surface stérile telle que des tampons autoclavés.
2. anesthésie
   1. Placez la souris dans la chambre d’induction et anesthésiez-la avec de l’isoflurane à 4 % (4 % dans de l’oxygène à 100 % à un débit de 1 L/min) jusqu’à ce que la fréquence respiratoire ralentisse à environ 60 respirations par minute (1 par seconde) (cela prend généralement <1 min).
      note: Ne laissez pas la souris dans la chambre trop longtemps, car cela pourrait entraîner l’asphyxie et la mort. N’ayez qu’une seule souris sous anesthésie à la fois.
   2. Transférez la souris sur le coussin chauffant sur la table d’opération, placez la souris avec son nez dans le cône nasal et maintenez l’état anesthésique avec 3-4 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène à un débit de 0,5 L/min. Surveillez la fréquence respiratoire pour vous assurer que la profondeur de l’anesthésie est maintenue.
      note: L’ASSISTANT doit surveiller la respiration de la souris tout au long de la chirurgie pour s’assurer que le bon niveau d’anesthésie est maintenu. Réduisez la concentration de l’anesthésique si la respiration devient trop lente ou augmentez la concentration si la profondeur de l’anesthésie est trop faible. Si la souris commence à haleter, retirez-la du cône nasal, diminuez la concentration anesthésique et attendez que la respiration se normalise avant de la placer à nouveau sur le cône nasal.
   3. Effectuez un « test de pincement » et un « test du réflexe cornéen » pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée avant de commencer l’opération.
      note: Le mouvement de n’importe quelle partie de la souris est une indication que la souris n’est pas complètement anesthésiée. L’animal doit immédiatement recevoir un anesthésique supplémentaire en augmentant la concentration de l’anesthésique.
   4. Couvrez les yeux de la souris avec une petite quantité de gel ophtalmique pour éviter la sécheresse oculaire.
3. Intervention chirurgicale
   1. Frottez la zone chirurgicale 3 fois avec de la chlorhexidine alcoolique. À l’aide d’une pince et d’une paire de ciseaux, faites une incision droite de 1 cm le long de la face dorsale, à 3 mm de la tumeur (Figure 2A, 2B).
      note: La standardisation de l’incision à 1 cm chez chaque souris (à l’aide d’une règle) permet une évaluation uniforme de la cicatrisation des plaies entre les souris. La localisation de l’incision à 3 mm de la tumeur permet un traitement adjuvant intratumoral ultérieur sans fuite de la plaie.
   2. À l’aide d’une pince à épiler, retirez le visage et le tissu adipeux sous-cutané entre la tumeur et le péritoine. La tumeur sous-cutanée est normalement attachée au côté de la peau.
   3. Ouvrez la plaie en tenant doucement la peau du côté porteur de la tumeur à l’aide d’une pince à épiler et « inversez » la tumeur pour qu’elle soit visible à l’extérieur (Figure 2C, 2D).
      note: La section de la tumeur à dégonfler doit être la plus proche de l’ouverture pour avoir suffisamment de peau pour fermer la plaie. Attention à ne pas couper la peau lors de l’ablation de la tumeur.
   4. À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez la capsule tumorale en deux pour la retirer, en commençant par la base de la tumeur la plus proche de l’ouverture.
   5. Pour une chirurgie de réduction de 50 %, coupez au milieu de la tumeur. À l’aide d’une pince incurvée, prélevez la section de la tumeur à enlever (50 %) ; Ramassez tous les restes de la zone débulkée.
   6. Pour une réduction de la tumeur de 75 %, effectuez une réduction de la tumeur de 50 % comme dans la partie 2.3.5 ci-dessus. Ensuite, coupez en deux les 50 % restants de la tumeur et ramassez 25 % de la tumeur à l’aide de pinces courbes comme décrit ci-dessus.
4. Fermeture du site chirurgical
   1. Replacez la tumeur restante sous la peau et, à l’aide d’une pince, rapprochez les lambeaux cutanés et alignez la peau le long de la plaie.
   2. Maintenez la peau à 5 mm du bord de la plaie et utilisez des clips chirurgicaux pour fermer la plaie, en commençant par le côté le plus proche de la pince. Appliquez autant de clips que nécessaire pour vous assurer qu’aucun tissu sous-jacent n’est exposé. En général, trois à quatre clips sont appliqués avec des espaces de 2 mm entre les clips.
      note: Si des clips ne sont pas bien appliqués, retirez-les à l’aide d’un dissolvant de clips et remplacez-les par des clips neufs.
5. Récupération des souris
   1. Laissez les souris récupérer en les plaçant dans la chambre de chauffe chaude (37 °C).
   2. Placez la cage de la souris sur le coussin chauffant. Surveillez les souris dans la chambre de chauffe jusqu’à ce qu’elles se soient remises de l’anesthésie (éveillées et en marchant), puis remettez-les dans la cage. Laissez la cage sur le coussin chauffant pendant 10 minutes supplémentaires, jusqu’à ce que les souris soient devenues plus actives.
   3. Donnez aux souris de la nourriture humide et molle. Surveillez les souris 1 heure après l’opération pour la récupération et assurez-vous que les clips restent en place. Assurez-vous que la cage est à moitié allumée ou à moitié hors du coussin chauffant pour permettre aux animaux de réguler eux-mêmes leur température sans surveillance.
   4. Administrer aux souris 0,1 mg/kg de buprénorphine (100 μL par voie sous-cutanée dans la peau du cou) 6 à 8 heures après la chirurgie (à la fin de la journée). Surveillez les souris tôt le lendemain matin et administrez-leur de nouveau 0,1 mg/kg de buprénorphine (100 μL par voie sous-cutanée dans la peau du cou). Donnez plus de nourriture humide au besoin.
   5. Surveillez les souris quotidiennement pendant les sept prochains jours. Les clips peuvent être retirés après sept jours à l’aide du dissolvant de clips.
6. Traitement adjuvant ou néoadjuvant
   1. Traiter les souris en périopératoire avec un traitement (néo)adjuvant à tout moment, en fonction du traitement d’intérêt.
   2. Par exemple, traitez les souris avec une dose de 100 μg d’anti-CTLA-4 par voie intrapéritonéale (i.p.) le 15e jour après l’inoculation ou avec trois doses de 200 μg d’anti--1 i.p. les jours 15, 17 et 19 après l’inoculation.

Résultats

Figure 1 : Images représentatives de la configuration de la chirurgie.(A) Une image complète de l’installation chirurgicale montrant les outils chirurgicaux (énumérés à l’étape 2.1) et l’appareil d’anesthésie. (B) Une image instantanée de la table d’opération montrant tous les matériaux à portée de main. (C) Une chambre de chauffe et un coussi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue à insuline de calibre 26 de 0,5 mL	Becton Dickinson, Australie	326769	aucun
2-Mercaptoéthanol	Life Technologies Australia Pty Ltd	21985023	aucun
Machine à gaz anesthétique	Darvall Vet, Australie	Réf. : 2848	aucun
Anti-CTLA-4	BioXcell, États-Unis	BE0164	aucun
Anti--1	BioXcell, États-Unis	BP0273	aucun
Chlorhydrate de buprénorphine injectable, 0,3 mg/mL	RB healthcare UK Limited, Royaume-Uni	Référence 55175	Ordonnance
Gommage chirurgical à la chlorhexidine 4 %	Perigo Australie, Australie	CHL01449F(gommage	aucun
Sérum fœtal bovin	CellSera, Australie	AU-FBS-PG	aucun
Pince fine 10,5 cm	Maison de chirurgie, Australie-Occidentale	CC74110	aucun
Pince fine 12 cm dentelée	Maison de chirurgie, Australie-Occidentale	CC74212	aucun
Pince Halsted 14 cm	Maison de chirurgie, Australie-Occidentale	CD01114	aucun
Chambre de chauffe	Datesand Ltd, Royaume-Uni	Mini-Thermacage	aucun
HEPES (1M)	Life Technologies Australia Pty Ltd	15630080	aucun
L’isoflurane	Henry Schein Animal Health, Australie	Réf. : 29405	Ordonnance
Pommade oculaire lubrifiante	Alcon	n/a	aucun
Pénicilline/streptomycine 1000X	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140122	aucun
Solution tamponnée au phosphate 10x	Life Technologies Australia Pty Ltd	Référence 70013-032	aucun
Clips Reflex 7 mm	Able scientific, Australie	AS59038	aucun
Reflex 7mm Clip Applicateur	Able scientific, Australie	AS59036	aucun
Extracteur de clips de plaie réflexe	Able scientific, Australie	AS59037	aucun
Circuit respiratoire d’anesthésie Rongeur Qube	Darvall Vet, Australie	Réf. 7885	aucun
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Moyen + L-glutamine	Life Technologies Australia Pty Ltd	21870092	aucun
Ciseaux Iris STR 11 cm	Maison de chirurgie, Australie-Occidentale	KF3211	aucun
Ciseaux Iris STR 9 cm	Maison de chirurgie, Australie-Occidentale	JH4209	aucun
Petite chambre d’induction	Darvall Vet, Australie	Réf. : 9630	aucun
TrypLE express 1x	Life Technologies Australia Pty Ltd	Référence 12604-021	aucun