Une technique de greffe de peau humaine dans un modèle murin

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Traitement d’un échantillon de peau humaine d’un donneur

NOTE : L’échantillon de peau humaine utilisé dans cette greffe était un grand échantillon prélevé sur l’abdomen d’un patient en bonne santé. L’échantillon doit mesurer au moins 15 cm x 7,5 cm. Les limitations de taille peuvent affecter le nombre de souris pour lesquelles la peau est disponible et le choix de la taille du greffon.

1. Maintenir l’échantillon de peau à des températures froides (sur glace ; 4 °C) avant la préparation et la greffe. Conservez l’échantillon humide dans un gobelet de prélèvement d’échantillon fermé avec la gaze imbibée d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   REMARQUE : Il n’est pas recommandé de conserver l’échantillon de peau à 4 °C pendant plus de 2 jours. Cependant, il existe des rapports où les échantillons de peau sont conservés pendant une période plus longue.
   prudence: Traitez tous les tissus humains avec les précautions standard contre les risques biologiques.
2. Préparez-vous à dermatome l’échantillon de peau humaine dans une hotte de culture tissulaire à pression négative stérilisée sur une planche de dissection stérilisée.
3. Placez l’échantillon de peau, épiderme vers le haut, sur la planche de dissection. Essuyez l’épiderme avec un tampon de préparation à l’alcool stérile, puis avec du PBS.
4. Fixez le bord le plus proche de la peau à l’aide d’une goupille en T dissectionnante de 1,5 pouce (voir le tableau des matériaux).
5. Dermatome l’échantillon de peau à une épaisseur de 400 μm, en appliquant une pression constante tout en coupant vers l’avant à un angle de 30° à 45°. Suivez toutes les instructions et mesures de sécurité spécifiques à l’instrument (voir la table des matériaux).
   REMARQUE : Pour plus de détails sur la technique du dermatome, veuillez consulter un rapport précédemment publié.
6. Préparez une boîte de Pétri de 100 mm x 20 mm en plaçant une gaze stérile imbibée de PBS stérile au fond de la boîte. Placez la peau, épiderme vers le haut, sur la gaze humide.
7. Scellez et couvrez les bords de la plaque avec un film d’étanchéité semi-transparent (voir le tableau des matériaux) pour vous assurer que l’échantillon n’est pas contaminé. Stocker l’échantillon à 4°C avant la greffe.

2. Conditionnement et préparation préopératoires

1. Préparez les instruments stériles et un poste chirurgical stérile pour la greffe. Utilisez des serviettes en papier autoclavées comme surfaces stériles pour le placement des instruments et des souris.
   REMARQUE : Les souris peuvent être greffées après le sevrage, mais sont de préférence greffées entre 8 et 10 semaines. Des souris des deux sexes peuvent être greffées.
2. Effectuez la préparation chirurgicale, comme l’épilation, dans une zone physiquement séparée du poste chirurgical.
3. Préparez l’anti-GR1 (voir tableau des matières) en le diluant à 1 mg/mL dans une solution saline stérile. Administrer à chaque souris 100 μg/100 μL de la solution anti-GR1 par voie intrapéritonéale après l’induction de l’anesthésie.
4. Anesthésier les souris, une à la fois, avec de l’isoflurane ou d’autres anesthésiques approuvés par l’établissement.
   REMARQUE : L’isoflurane doit être administré à une concentration de 3 % à 5 % pendant l’induction. Une fois que la souris est immobile, abaissez la concentration d’isoflurane à 1 % à 3 % pour affecter la durée de la chirurgie.
   1. Surveillez la souris pour détecter la profondeur appropriée de l’anesthésie en observant la fréquence respiratoire, l’absence de réponse par pincement des orteils et la coloration rose appropriée des oreilles et de la bouche.
      prudence: Utilisez des appareils d’anesthésie et des méthodes de balayage appropriés, et évitez l’exposition aux vapeurs d’isoflurane.
5. Transférez la souris sur un coussin chauffant ou une autre source de chaleur (voir le tableau des matériaux).
6. Administrez la pommade ophtalmique en tamponnant une petite goutte de pommade sur l’œil avec un doigt ganté.
7. Administrer les analgésiques Buprénorphine (0,08 mg/kg) et Carprofène (5 mg/kg) (voir Tableau des matières) par voie sous-cutanée en pinçant la peau et en injectant à un angle parallèle au corps.
   REMARQUE : Préparez l’analgésie pré-traitement en suivant les protocoles de l’établissement. Suivre les directives de l’établissement pour la sélection et l’administration des analgésiques. La méthode d’analgésie utilisée dans cette étude est décrite à l’étape 2.7 et à la figure 1.
8. Administrer l’anti-GR1 (préparé à l’étape 2.4) par voie intrapéritonéale en soulevant légèrement la souris par la queue, en exposant l’abdomen et en l’injectant à un angle de 30° à l’aide d’une seringue d’insuline de 1 mL (12,7 mm).
9. Utilisez des tondeuses électriques sans danger pour les animaux (voir le tableau des matériaux) pour raser les parties médiane et supérieure de la face dorsale de la souris.
10. Nettoyez tous les poils et appliquez une quantité généreuse de pommade dépilatoire sur la peau rasée pendant 30 s à 1 min.
11. Essuyez complètement la pommade dépilatoire avec une serviette en papier et du PBS.

3. Procédure de transplantation

1. Transférez la souris vers un emplacement chirurgical secondaire, loin de la station d’épilation.
2. Stérilisez le site chirurgical avec le bâtonnet d’écouvillon d’iode dans un mouvement circulaire, en commençant par le milieu et en progressant vers le bord de la zone épilée.
3. Placez un morceau de pellicule plastique stérile sur la souris et découpez une fenêtre dans le plastique légèrement plus grande que la taille de la zone à greffer.
4. Découpez une portion de peau donneuse en forme de rectangle de 10 mm x 10 mm à greffer avec un scalpel. Pour ce faire, maintenez fermement la peau du donneur en place avec l’arrière de la pince et coupez le long de la pince avec le scalpel.
5. À l’aide des ciseaux chirurgicaux, coupez une zone rectangulaire de peau de souris correspondant à la taille du morceau de peau du donneur, créant ainsi un lit de greffe. Utilisez des pinces pour éloigner la peau du corps et coupez la peau avec les ciseaux inclinés vers l’extérieur du corps pour éviter de couper profondément dans le visage.
6. Placez le morceau de peau du donneur, épiderme vers le haut, sur le lit de greffe préparé.
7. À l’aide de l’arrière de la pince, manipulez la peau en la faisant glisser d’avant en arrière jusqu’à ce que la peau du donneur repose complètement à plat contre le lit de greffe.
8. Ajoutez des gouttes de colle chirurgicale (voir le tableau des matériaux) à l’endroit où la peau du donneur rencontre la peau de la souris et maintenez la peau de la souris et du donneur ensemble avec une pince pendant 1 à 2 s afin que la colle adhère aux tissus. Scellez complètement le bord de la greffe et laissez la colle sécher complètement.
9. Bandez les souris (Figure 2) en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Coupez un morceau de gaze de vaseline (voir la table des matériaux) suffisamment grand pour couvrir complètement la zone de greffe.
   2. Couvrez le greffon avec la gaze de vaseline et appuyez légèrement la gaze contre la peau à l’aide d’une pince.
   3. Coupez une bande d'un film transparent dans le sens de la longueur de manière à ce que la largeur soit suffisamment grande pour couvrir la blessure de la souris.
   4. Appuyez fermement sur le pansement en film transparent, côté adhésif vers le bas, sur la gaze. Faites rouler rapidement la souris pour enrouler complètement le pansement autour du torse, en vous assurant qu’il est bien ajusté sans entraver la respiration et que tous les membres sont libres de mouvement.
   5. Placez la souris dans une cage de récupération et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit alerte et qu’elle se déplace. Fournir une source de chaleur sur une partie de la cage pendant au moins 15 min après la récupération.
      REMARQUE : On s’attend à ce que les animaux se rétablissent dans les 1 à 5 minutes suivant leur placement dans la cage de récupération.

Graphique 1 : Chronologie du protocole adopté pour l’étude de la xénogreffe.

Graphique 2 : Méthode de bandage de la souris après la chirurgie. La souris est étroitement enveloppée dans de la gaze de vaseline et un film transparent pendant l’anesthésie. (A) La gaze de vaseline est placée sur une zone légèrement plus grande que la plaie chirurgicale. (B) Le pansement en film transparent est préparé : une longue bande est coupée légèrement plus large que la gaze de vaseline. Le support recouvrant la face adhésive du pansement en film transparent est partiellement retiré. (C) Le côté adhésif du film est fermement pressé contre l’arrière de la souris, laissant un pouce d’espace sur l’extrémité avant du film. (D) La souris est tournée sur le dos. La partie avant en surplomb du film est pressée sur la souris et le support est retiré. (E) La souris est étroitement enveloppée dans le film et le support restant est retiré au fur et à mesure que la souris est enveloppée. (F) La souris est enveloppée avec succès dans le pansement, et ses bras et ses jambes ne sont pas contraints.