Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut. Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Mise en place d’un modèle basé sur la PBMC humaine
- Myéloablation de souris NOD/SCID à l’aide de cyclophosphamide : détermination des doses optimales
- Achetez des souris femelles non obèses diabétiques/immunodéficience combinée sévère (NOD/SCID) (6-8 semaines).
note: Toutes les souris impliquées dans cette étude étaient des femelles.
- Préparez du cyclophosphamide (PC) à différentes doses (50, 100 et 150 mg/kg) dans une solution saline. Préparer du disulfirame (DS) dans 0,8 % de Tween-80 dans une solution saline à 125 mg/kg
REMARQUE : Différentes concentrations de PC ont été préparées pour permettre l’administration de volumes égaux de solution médicamenteuse à des souris recevant différentes doses de PC.
- Traitez les animaux avec CP (intrapéritonéale, i.p.) et SD (peroral, p.o.) une fois par jour pendant 2 jours. Administrer DS (p.o.) 2 h après chaque dose de CP.
REMARQUE : Le SD diminue l’urotoxicité de la PC chez la souris, et il a été suggéré que la PC combinée à la SD ait une neutropénie plus durable que les animaux traités avec la PC seule. Il peut être nécessaire de prédéterminer la posologie de la PC avant les études proprement dites, et on a constaté qu’elle variait légèrement entre les différentes souches de souris immunodéficientes.
- Prélever des échantillons de sang du sinus veineux orbitaire et les transférer dans des tubes recouverts d’acide éthylènediaminetétraacétique de potassium (EDTA-K) sur de la glace le jour 0 (1 h avant la 1re dose), le jour 2 (24 h après la 2e dose) et le jour 4 (72 h après la 2e dose).
- Examiner l’effet de la myéloablation après un traitement par CP et SD par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Utilisez l’anti-souris CD11b (M1/70), l’anti-souris Ly6C (HK1.4) et l’anti-souris Ly6G (1A8) pour détecter les CD11b+Ly6Célevés comme les neutrophiles, CD11b+Ly6Célevés comme les monocytes.
- Enregistrez quotidiennement le poids corporel et l’état de santé des souris pendant une semaine. La dose optimale de PC et de DS est déterminée comme le régime qui entraîne une déplétion maximale des neutrophiles et des monocytes sans causer de toxicité grave pour les souris.
- Transplantation PBMC humaine et greffe de tumeur : mise en place du modèle
- Isoler les PBMC humains de donneurs sains par centrifugation à gradient de densité selon les instructions du fabricant.
- Prétraitez les souris avec CP et SD comme indiqué aux étapes 1.1.2 et 1.1.3 pour augmenter l’efficacité de la transplantation.
- 20 à 24 h après la deuxième dose de CP et de DS, injecter des lignées cellulaires tumorales humaines telles que des cellules A431 (ATCC, 2,5 x 106) et 5 x 106 PBMC isolés (mélangés dans un total de 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 50 % de Matrigel), ou des fragments de tumeur (3 x 3 x 3 mm3, dans un volume total de 200 μL PBS contenant 50 % de Matrigel) et 200 μL de 5 x 106 PBMC (100 μL chacun à gauche et à droite du fragment de tumeur greffé) par voie sous-cutanée (s.c.) dans le flanc droit des animaux.
- Mesurez le volume de la tumeur primaire et enregistrez-la deux fois par semaine pendant 4 à 6 semaines.
note: Les souris seront euthanasiées une fois que leur poids corporel aura perdu plus de 20 % ou que leur volume tumoral aura atteint 2 000mm3 ou que la tumeur aura été ulcérée.
- Euthanasier les souris dans des chambres à gaz avec du dioxyde de carbone. Collectez l’ensemble des tissus tumoraux de souris sacrifiées à l’aide de ciseaux ophtalmiques et traitez-les pour l’analyse histologique et immunohistochimique (IHC). Examiner les expressions humaines de CD8,-1 et-L1 dans ces tissus.
