Inhibition de l’autophagie par siRNA dans des cellules dendritiques immatures infectées par le virus de l’herpès simplex

Résumé

Source : Düthorn, A., et al. siRNA pour moduler l’autophagie dans les cellules dendritiques dérivées de monocytes infectées par le virus de l’herpès simplex de type 1. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre une technique basée sur un petit ARN interférent (siRNA) pour interférer avec le flux autophagique. Un siRNA ciblant l’ARNm FIP200 est introduit dans des cellules dendritiques immatures (iDC) dérivées de monocytes par électroporation, provoquant l’inhibition de l’expression de FIP200 et conduisant à l’inhibition de la rupture de la lamine nucléaire par autophagie. Lors de l’ajout du virus de l’herpès simplex (HSV), la sortie nucléaire de la descendance virale est inhibée en raison de l’absence de perturbation de la lamine par flux autophagique.

Protocole

Des CD dérivés de monocytes ont été générés à partir de produits de leucaphérèse de donneurs sains. Pour cela, un vote positif de la commission d’éthique locale a été obtenu (numéro de référence 4556). Les expériences de la présente étude ont été réalisées conformément aux recommandations du comité d’éthique de la « Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg » (numéro de référence 4556). Tous les donateurs ont approuvé un consentement éclairé écrit, y compris conformément à la Déclaration d’Helsinki.

1. Génération et manipulation de cellules dendritiques immatures (iDC) et de cellules dendritiques matures (mDC)

1. Isoler les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) des chambres du système de leucoréduction (LRSC) comme décrit précédemment. Évitez la cryoconservation des PBMC et utilisez-les directement lors de l’isolement pour obtenir des rendements en courant continu plus élevés.
2. Générer des CD humains à partir de PBMC de différents donneurs sains dans des flacons de culture cellulaire T175, comme décrit précédemment. En bref, utilisez 350 à 400 millions de PBMC dans 30 mL de milieu DC (RPMI 1640 sans L-glutamine, 1 % (v/v) de sérum humain de type AB (AB-sérum), 100 U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine, 0,4 mM de L-glutamine, 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES)) par flacon de culture cellulaire pour isoler les monocytes par adhérence. Après 1 h, rincer la fraction non adhérente à l’aide du RPMI 1640. Ajouter un milieu DC frais complété par 800 U/mL de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et 250 U/mL d’interleukine-4 (IL-4), et incuber pendant 3 jours.
   1. Le 3e jour après l’observance, ajouter 5 mL de milieu de DC frais contenant du GM-CSF et de l’IL-4 avec une concentration finale de 400 U/mL et 250 U/mL par flacon de culture cellulaire, respectivement, pour la différenciation des CD.
   2. Pour récolter les iDC, rincez doucement les iDC peu adhérents du fond du flacon de culture cellulaire, le 4e jour après l’adhésion. Répétez cette étape 2 fois. Pour la génération de mDCs, ajouter un cocktail de maturation composé comme suit : GM-CSF (concentration finale : 40 U/mL), IL-4 (concentration finale : 250 U/mL), interleukine-6 (IL-6, concentration finale : 1000 U/mL), interleukine-1 bêta (IL-1β, concentration finale : 200 U/mL), facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α, concentration finale : 10 ng/mL), prostaglandine E2 (PGE2 ; concentration finale : 1 μg/mL).
   3. Six jours après l’observance (deux jours après l’induction de la maturation à l’aide d’un cocktail de cytokines), rincez les mDC du fond de la fiole de culture cellulaire. Répétez cette étape deux fois.
      note: Des CD immatures et matures peuvent être générées séquentiellement à partir de donneurs identiques dans 1 flacon de culture cellulaire. Pour ce faire, (i) séparer le nombre approprié d’iDC et (ii) induire la maturation des cellules restantes dans les flacons à l’aide du cocktail de cytokines mentionné à l’étape 1.2.2.
3. Transférez les iDC ou les mDC dans le milieu de culture cellulaire respectif dans des tubes de 50 mL. Récoltez les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min.
   1. Remettre doucement en suspension (= laver) les DC dans 5 à 10 mL de RPMI 1640 par flacon de culture cellulaire. Combinez les suspensions DC respectives dans un seul tube.
   2. Définissez le numéro de cellule à l’aide d’une chambre de comptage ou d’une autre méthode. Évitez les changements de température lors de la manipulation des iDC, afin de réduire le risque de changements phénotypiques.

2. Analyses cytométriques en flux pour suivre l’état de maturation phénotypique

1. Transférez les iDC ou mDC (0,5 x 10⁶) de l’étape 1.3.1 dans un tube de 1,5 mL. Récolter les cellules par centrifugation à 3390 x g pendant 1,5 min. Lavez les cellules une fois avec un tampon FACS (PBS complété par 2 % de sérum de veau fœtal (FCS)).
2. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de solution de coloration des anticorps (tampon FACS) contenant des anticorps spécifiques marqués au fluorochrome contre des molécules de surface définies.
   1. Utilisez les anticorps suivants pour vérifier la pureté (isothiocyanate de fluorescéine CD3 [FITC], CD14-phycoérythrine [PE]) ainsi que l’état de maturation des CD (CD80-PacBlue [Pacific Blue]/-PE-cyanine5 [Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).
   2. Préparez un échantillon non coloré dans 100 μL de tampon FACS comme contrôle.
   3. Teindre les cellules sur de la glace dans l’obscurité pendant 30 min.
3. Ensuite, laver les cellules deux fois dans 1 mL de tampon FACS et centrifuger à 3390 x g pendant 1,5 min.
4. Enfin, remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS complété par 2 % de paraformaldéhyde (PFA) et analyser les cellules par cytométrie en flux. Les cellules fixes peuvent être stockées à 4°C dans l’obscurité jusqu’à 2 jours.

3. Interférence du flux autophagique induit par HSV-1 par électroporation d’iDC à l’aide de FIP200-siRNA

REMARQUE : Le protocole actuel pour l’électroporation par siRNA a été modifié à partir de Prechtel et al. (2007) et Gerer et al. (2017).

1. Transférer les iDC (12 x 10⁶) au jour 3,5 après l’adhérence dans un tube de 50 mL. Ensuite, centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min et jetez le surnageant. En parallèle, effectuez une analyse par cytométrie en flux pour surveiller l’état de maturation comme décrit à l’étape 2 (Utiliser Life/Dead violet au lieu de CD80-PacBlue).
2. Laver délicatement les iDC dans 5 mL d’OptiMEM sans rouge de phénol et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre doucement en suspension les iDC dans 200 μL d’OptiMEM sans rouge de phénol, en ajustant une concentration cellulaire de 6 x 10⁶/100 μL. Ne placez pas les cellules sur de la glace et évitez les changements de température. Passez rapidement à autre chose et évitez les longues périodes d’incubation des iDC dans OptiMEM sans rouge de phénol.
3. Transférez soit 75 pmol de siRNA spécifique de FIP200, soit 75 pmol de siRNA brouillé, comme contrôle, dans des électrocuvettes de 4 mm et ajoutez 100 μL (6x10⁶ cellules) de la suspension cellulaire. Pulsez directement les iDC à l’aide de l’appareil d’électroporation I, en appliquant les réglages suivants : 500 V pendant 1 ms.
   1. Avant la procédure expérimentale, préparez les suspensions de siRNA selon les instructions du fabricant, aliquotez-les et stockez-les à -20 °C. Décongelez-les et conservez-les sur de la glace lorsque vous utilisez ces siRNA pour l'électroporation. Avant d’électroporer les échantillons, effectuez une impulsion de test.
4. Après électroporation, transférez directement l’iDC dans des plaques à 6 puits avec un milieu DC frais préchauffé (complété par 40 U/mL de GM-CSF et 250 U/mL d’IL-4). Ensemencez les cellules à une concentration finale de 1 x 10⁶/mL et placez-les dans un incubateur. Ne rincez pas les cellules de la cuvette électrique.
5. Après 48 h, examinez d’abord la morphologie des iDC électroporés au microscope. Ensuite, récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir et transférez-les dans des tubes de 15 ml. Rincer les puits avec 1 mL de PBS complété par de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,01 % et transférer la solution dans les tubes respectifs.
6. Par la suite, divisez 6 x 10⁶ iDC par condition de siRNA comme décrit dans les étapes suivantes.
   1. Utilisez^0,5 x 10 6 cellules pour évaluer l’état de maturation et la viabilité cellulaire comme décrit à l’étape 2. Utilisez les anticorps suivants : CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 et Life/Dead violet.
   2. Utilisez 1 x 10⁶ cellules pour les analyses par Western blot afin de vérifier l’efficacité de renversement spécifique à FIP200. Transférez et récoltez les cellules dans un tube safelock de 1,5 mL par centrifugation à 3390 x g pendant 1,5 min. Préparer les lysats cellulaires et effectuer des analyses par transfert de Western.
   3. Utilisez les cellules restantes (4,5 x 10⁶) pour les expériences d’infection par le HSV-1. Pour chaque condition expérimentale, transférez 2,25 x 10⁶ iDC dans des tubes de 2 mL et infectez-les avec le HSV1 à une multiplicité d’infection (MOI) de 2 ou ajoutez un tampon MNT comme témoin fictif. Effectuez l’infection comme décrit.
   4. 20 h après l’infection (hpi), prélever les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et préparer les lysats cellulaires pour les analyses par transfert Western.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Unité centrale 4D-Nucleofector (appareil d’électroporation II)	Lonza (Bâle, Suisse)	AAF-1002B
Sérum AB	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Allemagne)	N° H4522	Culture de cellules dendritiques
ACD-A	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Allemagne)	9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (kit d’électroporation appareil II)	Lonza (Bâle, Suisse)	V4XP-3024
Réactif de détection par transfert Amersham ECL Prime Western	GE Healthcare (Solingen, Allemagne)	RPN2232	Détection par transfert Western
Persulfate d’ammonium (APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Allemagne)	A3678
anti-IgG de souris (souris, polyclonale, HRP)	Signalisation cellulaire (Leiden, Pays-Bas)	Référence 7076	Détection par transfert Western
anti-IgG de lapin (chèvre, polyclonale, HRP)	Signalisation cellulaire (Leiden, Pays-Bas)	N° 7074	Détection par transfert Western
Cytomètre en flux BD FACS Canto II	BD Biosciences (Heidelberg, Allemagne)	338962
Chambre buvard Fastblot B44	Biometra (Göttingen, Allemagne)	Référence 846-015-100
CCR7 (souris, Pe-Cy7)	BioLegend (Fell, Allemagne)	557648	Cytométrie en flux Dilution : 1:100 Clone : G043H7
CD11c (souris, Pe-Cy5)	BD Biosciences (Heidelberg, Allemagne)	561692	Cytométrie en flux Dilution : 1:100 Clone : B-ly6
CD14 (souris, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Allemagne)	555398	Cytométrie en flux Dilution : 1:100 Clone : M5E2
CD3 (souris, FITC)	BD Biosciences (Heidelberg, Allemagne)	555332	Cytométrie en flux Dilution : 1:100 Clone : UCHT1
CD80 (souris, V450)	BD Biosciences (Heidelberg, Allemagne)	560442	Cytométrie en flux Dilution : 1:100 Clone : L307.4
CD83 (souris, APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Allemagne)	Tél. : 17-0839-41	Cytométrie en flux Dilution : 1:200 Clone : HB15e
CD86 (souris, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Allemagne)	553692	Cytométrie en flux Dilution : 1:100
Imagerie cellulaire EVOS FL	Système AMG/Life Technologies (Carlsbad, États-Unis)	AMF4300
FIP200 (lapin)	Signalisation cellulaire (Leiden, Pays-Bas)	Référence 12436	Détection par transfert de Western Dilution : 1:1000 Clone : D10D11
Appareil Gene Pulser II (appareil d’électroporation I)	BioRad Laboratories GmbH (Munich, Allemagne)	Référence 165-2112
GM-CSF (4 x 104 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Allemagne)	Tél. : 130-093-868
HLA-DR (souris, APC-Cy7)	BioLegend (Fell, Allemagne)	307618	Cytométrie en flux Dilution : 1:200 Clone : L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	BioVex		Infection DC
IL-1β (0,1 x 106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Fribourg, Allemagne)	Référence 1411-050
IL-4 (1 x 106 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Allemagne)	Tél. : 130-093-924
IL-6 (1 x 106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Fribourg, Allemagne)	Référence 1404-050
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare (Solingen, Allemagne)	28955810
L-glutamine	Lonza (Bâle, Suisse)	17-605E
LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes violettes fixable	Life Technologies (Carlsbad, CA, États-Unis)	N° L34964	Coloration L/D en cytométrie en flux
Lymphoprep	Alere Technologies AS (Oslo, Norvège)	Référence : 04-03-9391/01
chlorure de magnésium	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Allemagne)	A537.1
Megafuge 2.0 RS	Heraeus (Hanau, Allemagne)	75015505
Chambre de comptage Neubauer	Brand (Wertheim, Allemagne)	717805
Fioles de culture cellulaire Nunc (175.0 cm2)	Thermo Scientific (Rockford, États-Unis)	Référence 159910
Paraformaldéhyde, 16 %	Alfa Aesar, Haverhill, États-Unis	43368.9M
PerfectSpin 24 Plus	Peqlab (Erlangen, Allemagne)	C2500-R-PL
EGP2 (1 mg/mL)	Pfizer (Berlin, Allemagne)	BE130681
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Lonza (Bâle, Suisse)	17-512F
Tampon de décapage Western Blot RestoreTM	Thermo Scientific, Rockford, États-Unis	Référence 21059
Plate-forme basculante wt 15	Biometra (Göttingen, Allemagne)	Référence 042-590
RotiBlock	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Allemagne)	L151.4
Roti-Load 1 (4x)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Allemagne)	K929.3
Gel de rotiphorèse 30 (37,5:1)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Allemagne)	Référence 3029.1
RPMI 1640	Lonza (Bâle, Suisse)	12-167F
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Allemagne)	2326.2
Confort du thermomixeur	Eppendorf (Hambourg, Allemagne)	Référence 5355 000.011
TNF-α (10 μg/mL)	Peprotech (Hambourg, Allemagne)	Référence 300-01A
Tris	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Allemagne)	4855,3
Solution de bleu de trypan (0,4 %)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Allemagne)	Réf. T8154
Préadolescent 20	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Allemagne)	Référence 9127.1
Membrane nitrocellulosique Whatman 0,2 μm	GE Healthcare (Solingen, Allemagne)	10600001
WhatmanTM Papier de chromatographie 3 mm Chr	Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Allemagne)	3030917