Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparatifs avant de commencer l’opération
- Stériliser les instruments chirurgicaux (c.-à-d. par autoclavage).
- Diluez le virus à la concentration appropriée, qui variera en fonction de la toxicité du virus spécifique utilisé et de la sensibilité de la souche de rat.
REMARQUE : Par exemple, lors de l’utilisation du virus de la stomatite vésiculeuse chez des rats Buffalo mâles, nous injectons généralement 107 unité formant une plaque (pfu) dans un volume de 1 ml, ce qui est la dose maximale tolérée dans ce modèle.
- Préremplissez le virus (en utilisant la technique aseptique) dans des seringues de 1 ml et fixez des aiguilles de 30 G en prenant soin d’éliminer l’air de la seringue et de l’aiguille.
- Préparez l’espace chirurgical avec tout le matériel et l’équipement nécessaires, et vaporisez la zone avec de l’éthanol pour désinfecter. Remplissez un petit récipient avec une solution saline stérile (chlorure de sodium à 0,9 %, NaCl) pour humidifier les écouvillons de gaze et les applicateurs à embout de coton.
2. Préparation du rat
- Administrer un analgésique (tel que spécifié par le comité local de soin et d’utilisation des animaux), à la dose appropriée 30 minutes avant le début de l’intervention chirurgicale. Par exemple, administrez une forte dose de métamizole (100-200 mg/kg).
- Anesthésier le rat à l’aide d’un anesthésique par inhalation (isoflurane) ou injectable (c.-à-d. un mélange de médétomidine (0,15 mg/kg), de midazolam (2 mg/kg) et de fentanyl (0,005 mg/kg), également connu sous le nom de MMF). Administrez l’isolflurane à l’aide d’un vaporisateur à 1-3 % et ajustez si nécessaire pour maintenir une respiration et un rythme cardiaque normaux.
- Avant de continuer, assurez-vous que le rat est complètement sous sédatif et incapable de ressentir la douleur en pinçant le coussinet du pied et en observant une réaction.
- Appliquez une pommade vétérinaire pour les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie.
- Rasez la région abdominale du sternum jusqu’au-dessus des organes génitaux à l’aide d’une petite tondeuse à cheveux vétérinaire. Prenez soin d’obtenir un rasage de près sans blesser la peau.
- Fixez le rat au lit chirurgical à l’aide de ruban adhésif sur les membres antérieurs et postérieurs et, si vous utilisez une anesthésie par inhalation, placez le museau dans un cône nasal de taille appropriée. Placez un coussin chauffant sous le rat pour maintenir la température corporelle. Désinfectez la région abdominale à l’aide d’un désinfectant de qualité chirurgicale, suivi d’un rinçage à l’alcool et de l’application d’une peinture antiseptique.
3. Laparotomie
- À l’aide d’un petit scalpel incurvé, tel que le #15, faites une petite incision verticale dans la couche de peau directement le long de la ligne médiane. Étendez l’incision jusqu’au processus xyphoïde. Ensuite, incisez la couche musculaire en la soulevant doucement avec une paire de pinces Adson pour faire une incision au scalpel, puis étendez l’incision jusqu’au processus xyphoïde avec des ciseaux chirurgicaux. Veillez à ne pas percer les organes de la cavité abdominale ou à endommager les petits vaisseaux de part et d’autre de l’apophyse xyphoïde.
- Placez un écarteur sur l’abdomen pour écarter le muscle et la peau et exposer toute la région abdominale.
- Humidifiez deux tampons de gaze de7,5 x 7,5 cm 2 avec une solution saline physiologique stérile et étalez-en un sur le haut de l’ouverture chirurgicale et un sur le bas, comme le montre la figure 1A.
4. Isolement de l’artère hépatique
- À l’aide de deux cotons-tiges humidifiés imbibés d’une solution saline physiologique stérile, soulevez doucement les intestins et le caecum de la cavité abdominale et placez-les sur l’écouvillon de gaze inférieur. Repliez la gaze pour garder les organes humides et pour les tenir à l’écart.
- À l’aide de deux cotons-tiges imbibés d’un coton-tige, soulevez doucement le lobe latéral gauche du foie, qui sera le lobe le plus prédominant à ce stade. Retournez le lobe vers le haut et, à l’aide d’une petite paire de ciseaux à ressort, coupez la membrane fibreuse sous le lobe, permettant au lobe d’être complètement retourné vers le haut et de reposer sur l’écouvillon de gaze préalablement placé. Repliez l’écouvillon de gaze sur le lobe pour le maintenir en place.
- Continuez avec le lobe suivant (le caudé antérieur), qui est maintenant le lobe le plus antérieur en vue. À l’aide d’un microscope de dissection et d’une pince fine, disséquez la fine membrane entourant le lobe afin de le libérer et de lui permettre d’être librement retourné vers le haut. Placez le lobe sous l’écouvillon de gaze avec le lobe latéral gauche.
- Observez le lobe caudé postérieur, qui sera maintenant visible. Répétez l’étape 4.3 pour disséquer complètement le lobe caudé postérieur et retournez-le vers le haut et à l’intérieur de la gaze avec les lobes du foie précédemment placés.
- Juste en dessous de la position d’origine du lobe caudé se trouve l’artère hépatique commune, qui sera maintenant visible et facilement reconnaissable à sa forte pulsation. En suivant l’artère vers l’anatomie droite, observez l’épais matériau membraneux qui masque les artères gastroduodénales et hépatiques propres. À l’aide d’une pince fine, soulevez ce matériau et déchirez-le doucement, en prenant soin d’éviter tout petit vaisseau dans cette zone. Utilisez des cotons-tiges applicateurs pour arrêter tout saignement qui pourrait survenir.
- Localisez les branches artérielles, qui seront clairement visibles à l’aide d’un microscope de dissection lorsque les membranes seront correctement disséquées.
- À l’aide de deux pinces fines et atraumatiques, disséquez soigneusement l’artère hépatique commune, l’artère gastroduodénale et l’artère hépatique proprement dite de manière à ce qu’elles soient libérées des membranes environnantes (Figure 1B).
5. Préparation de l’artère pour l’injection
- Passez une suture Prolene 7-0 sous l’artère gastroduodénale et utilisez un porte-micro-aiguille pour attacher une ligature permanente à l’extrémité distale, juste au-dessus de la bifurcation (voir la figure 2 pour un placement correct). Laissez environ 2 pouces de matériel de suture sur les extrémités et fixez-les avec un porte-aiguille pour tirer l’artère enseignée, comme dans la figure 1C.
- Placez une petite pince sur l’artère hépatique commune pour bloquer temporairement le flux sanguin (Figure 1C).
REMARQUE : Ceci est important pour prévenir un saignement massif une fois que l’aiguille est retirée de l’artère. De plus, le blocage du flux sanguin artériel permettra une administration plus lente du virus et une meilleure efficacité de transduction.
- Important : Travaillez rapidement pour limiter le temps pendant lequel le flux sanguin est arrêté - effectuez l’injection et la ligature ultérieure de l’artère dans les 5 minutes suivant le clampage de l’artère hépatique commune.
- Si possible, augmentez le grossissement sur le microscope de dissection, de sorte que l’artère gastroduodénale soit nette et semble suffisamment grande pour insérer avec précision l’aiguille de 30 G. Placez l’aiguille de la seringue d’injection dans la lumière de l’artère gastroduodénale et poussez lentement sur le piston.
REMARQUE : Un bon placement de l’aiguille fera en sorte que la solution injectée s’écoulera directement à travers l’artère hépatique appropriée et vers le foie.
- Effectuez l’injection très lentement pour maximiser l’efficacité de la transduction.
- Une fois que tout le volume d’injection a été administré, rétractez lentement l’aiguille de l’artère.
REMARQUE : Il ne devrait pas y avoir de saignement du site d’injection. Dans le cas où un saignement se produit, cela indique que la pince n’est pas correctement placée et doit être ajustée rapidement.
6. Fermeture
- Passez une deuxième suture Prolene 7-0 sous l’artère gastroduodénale et attachez une deuxième ligature permanente au-dessus du site d’injection.
- Retirez la pince de l’artère hépatique commune. Confirmez que le flux sanguin dans l’artère hépatique appropriée vers le foie a été rétabli.
- Coupez les extrémités libres des ligatures.
- Confirmez qu’il n’y a pas de saignement avant de ramener les intestins et le foie dans la cavité abdominale. Veillez à ce que l’appendice soit renvoyé dans son orientation d’origine.
- Suturez le muscle et la peau en couches séparées à l’aide d’un matériau de suture vicryl 4-0 avec une aiguille incurvée. Placez les sutures continues à environ 1 mm d’intervalle et tirez fermement.
- Pendant la phase de suture, administrer un analgésique tel que la buprénorphine (0,05 mg/kg).
- Retirez le rat de l’anesthésie. Si l’isoflurane a été utilisé, le rat devrait reprendre conscience en quelques minutes. Si la MMF a été utilisée comme anesthésie injectable, antagonisez-la avec une injection sous-cutanée d’atipamézole (0,75 mg/kg), de flumazénil (0,2 mg/kg) et de naloxone (9,12 mg/kg), ce qui inversera les effets de l’anesthésie et permettra aux animaux de reprendre conscience dans les 20 minutes. Gardez les rats au chaud avec une lampe chauffante infrarouge pendant la phase de réveil initiale.
- Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
- Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.
