Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Animaux
- Cultivez des souris femelles C57BL6/J jusqu’à l’âge de 8 semaines dans des cages ventilées individuellement avec des filtres de micro-isolement.
REMARQUE : Les femmes sont préférées car la conformation anatomique de leur appareil urogénital externe rend le cathétérisme plus facile que chez les hommes.
2. Culture cellulaire
- Maintenir la lignée cellulaire de carcinome urothélial de souris MB49 dans le milieu RPMI 1640 complétée par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur et 50 μg/ml de gentamicine à 37 °C dans du dioxyde de carbone (CO2) humidifié à 5 %.
- Cultivez des cellules MB49 dans des flacons T-75 jusqu’à une confluence de 80 %. Trypsiniser et remettre en suspension à 0,5 × 105 - 0,5 × 106 cellules par 150 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant l’implantation chez la souris.
3. Implant de tumeur intravésicale
- Anesthésier les souris à l’aide d’un mélange des anesthésiques zoletil et xylor (33 mg/kg et 20 mg/kg, respectivement), injecté par voie intrapéritonéale.
- Placez les animaux en position couchée et fixez les pattes arrière au coussinet avec du scotch. Les pattes doivent être suffisamment séparées pour rendre le méat urétral bien visible et facilement accessible pour l’insertion d’un cathéter.
- REMARQUE : Pour le cathétérisme, un cathéter veineux pédiatrique de 24 G convient aux souris âgées de 8 à 10 semaines. Le choix du cathéter est essentiel pour éviter les fuites de liquide entre la paroi urétrale et le cathéter. Des cathéters de plus grand calibre doivent être utilisés pour les souris plus grandes ou plus âgées.
- À l’aide d’une petite pince, pincez un bord de la partie externe de l’urètre et tournez-le très doucement vers la « tête » des souris. Cette action expose le méat urétral.
- Retirez l’aiguille interne du cathéter et insérez-le dans l’urètre à un angle de 45°, légèrement orienté vers « l’extrémité arrière » des souris. Ne forcez pas l’entrée du cathéter ; En cas de résistance, il suffit de tourner le cathéter très doucement jusqu’à ce qu’il se glisse à l’intérieur de l’urètre. Lorsqu’environ 0,5 à 0,8 cm du cathéter se trouve dans l’urètre, placez soigneusement le cathéter parallèlement à la queue des souris et insérez-le complètement.
- À l’aide d’une seringue de 1 ml, dont l’aiguille doit être insérée dans le cathéter, laver la vessie de l’urine résiduelle en injectant 200 à 300 μl de PBS stérile et aspirer tout le liquide de la vessie.
- REMARQUE : Lors de l’injection de PBS, la vessie se remplira et un gonflement sera visible entre les pattes arrière des souris, ce qui confirme que le cathétérisme est correct. La plupart des cathéters ont un volume mort qui doit être pris en compte lors du calcul du volume d’injection.
- À l’aide d’une seringue stérile de 1 ml, injecter 200 μl d’acide chlorhydrique 0,1 N (HCl). Remplissez la vessie pour brûler toute sa paroi. Après 10 secondes, retirez tout l’acide et neutralisez immédiatement en injectant 200 μl d’hydroxyde de sodium 0,1 N (NaOH) avec une seringue stérile. Dans le cas de l’injection du plus grand nombre de cellules (0,5 × 106), l’étape d’acidification n’est pas nécessaire.
- Aspirez tout le liquide résiduel et rincez immédiatement la cavité avec 300 μl de PBS stérile.
- Vider la vessie par aspiration et injecter 150 μl de PBS contenant des cellules MB49 (plage 0,5 × 10,5 - 0,5 × 10,6) dans la vessie. Laissez la seringue assemblée sur le cathéter pour éviter la fuite des cellules. Il est préférable de fixer la seringue en la fixant au tampon avec du scotch.
- Après 1 heure, extrayez doucement le cathéter de l’urètre et placez les souris dans la cage sous une lampe à incandescence jusqu’à ce qu’elles se réveillent : cela se produit généralement entre 1 et 2 heures après la fin du traitement.
4. Administration intravésicale de la protéine activatrice des neutrophiles d’Helicobacter pylori (HP-NAP)
- REMARQUE : Au moins 3 jours après l’instillation cellulaire, il est possible de commencer le traitement.
- Cathétériser comme décrit aux étapes 3.1 à 3.4. À ce stade, il n’est pas nécessaire de brûler la paroi de la vessie avec du HCl.
- À l’aide d’une seringue de 1 ml, laver la vessie de l’urine résiduelle en injectant 200 à 300 μl de PBS stérile et aspirer tout le liquide de la vessie.
- Injecter 50 μg de HP-NAP par 150 μl de PBS dans la vessie. Laissez la seringue attachée au cathéter pour éviter les fuites de la solution protéique. Fixez la seringue en la fixant au tampon à l’aide de ruban adhésif.
- Après 1 heure, extrayez doucement le cathéter de l’urètre et placez les souris dans la cage sous une lampe à incandescence jusqu’à ce qu’elles se réveillent.
