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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le local
comité institutionnel de protection des animaux et le conseil d’examen vétérinaire JoVE. Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Génération de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’Ag viral à partir d’iPSC (cellules T iPSC-CD8+)
- Création des constructions rétrovirales
note: Les gènes α et β du récepteur des lymphocytes T (TCR) sont liés à la séquence d’auto-clivage 2A. Le vecteur rétroviral MSCV-IRES-DsRed (MiDR) est DsRed+.
- Introduisez le sous-clone HBs183-191 (FLLTRILTI) dans le MiDR pour créer la construction du MiDR s183 (Figure 1A).
- Transduction rétrovirale
REMARQUE : Les cellules Platinum-E (Plat-E) sont utilisées pour l’emballage des rétrovirus (porteurs des gènes TCR s183), qui seront utilisés pour la transduction rétrovirale. Les cellules Plat-E sont des cellules d’emballage rétrovirales efficaces sous-jacentes aux cellules 293T, qui ont été développées au moyen de constructions d’emballage uniques via le promoteur EF1α pour exprimer la protéine de structure rétrovirale, y compris gag, pol et env écotropique.
- Sur une boîte de culture de 100 mm, ensemencer 3 x 10 cellules6 Plat-E dans 8 mL de milieu de culture DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal (SCF) dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2, 1 jour avant la transfection.
- Le jour 0, transfectez la construction MiDR s183 dans les cellules Plat-E à l’aide d’un réactif de transfection d’ADN.
- Le jour 1, ensemencez 1 x 106 iPSC (protéine fluorescente verte [GFP]+) dans une plaque de culture pré-enrobée de gélatine.
- Les jours 2 et 3, prélever le surnageant contenant des rétrovirus à partir d’une culture cellulaire Plat-E pour transduire les iPSC avec le TCR s183 en présence d’une solution de 1,6-dibromohexane.
- Le jour 4, trypsiniser les iPSC transduites par le gène s183 TCR, centrifuger à 400 x g pendant 5 min et semer 3 × 105 iPSC dans une boîte de culture de 100 mm pré-enrobée de 3 x 106 cellules nourricières SNL76/7 irradiées (irSNL76/7).
- Au jour 5 ou 6 de la confluence, trypsiniser les cellules, centrifuger à 400 x g pendant 5 min et procéder au tri des cellules. Sur des cellules vivantes, triez les cellules doublement positives GFP et DsRED (les iPSC transduites par le gène TCR s183) à l’aide d’un trieur de cellules à grande vitesse. Comme à l’étape 1.2.5, co-cultivez les cellules triées sur des cellules nourricières irSNL76/7 pour une utilisation future.
- Différenciation des lymphocytes T iPSC-CD8+ spécifiques du VHB
REMARQUE : Les cellules stromales OP9-DL1/DL4 surexpriment les ligands Notch DL1 et DL4, et la co-culture d’iPSC avec les iPSC peut favoriser la différenciation des lymphocytes T médiée par la signalisation Notch.
- Cultivez des iPSC transduites par le gène s183 TCR (s183/iPSC) dans la monocouche cellulaire OP9-DL1-DL4 dans un milieu essentiel α-minimum (MEM) contenant 20 % de sérum bovin fœtal (FBS). Inclure dans la culture un ligand tyrosine kinase 3 (Flt3) murin de type FMS (mFlt-3L ; concentration finale = 5 ng/mL).
- Le jour 0, semez 0,5–1,0 x 105 S183/iPSC dans une boîte de culture de 10 cm préalablement cultivée avec des cellules OP9-DL1-DL4. Valider que les cellules OP9-DL1-DL4 sont dans un état de confluence de 80 % à 90 %.
- Le jour 5, rincez les CSPi avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), aspirez le PBS, ajoutez-le à 4 ml de trypsine à 0,25 % et incubez dans un incubateur à 37 °C pendant 10 min. Ensuite, ajoutez 8 ml supplémentaires de milieu de CSPi pour arrêter la digestion de la trypsine. Accumulez toutes les solutions digestives contenant les cellules et centrifugez à 400 x g pendant 5 min à 15–30 °C.
- Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu iPSC. Transférez la suspension cellulaire dans une nouvelle plaque de Pétri de 10 cm et incubez dans un incubateur pendant 30 min à 37 °C.
- Après 30 min, récupérez le média iPSC contenant les cellules flottantes. Faites passer la suspension cellulaire dans une crépine de 70 μm et calculez le nombre de cellules.
- Semez 5 x 10cellules 5 dans la boîte de culture avec des cellules OP9-DL1-DL4 précédemment cultivées avec une condition de 80 à 90 % de confluent, comme décrit à l’étape 1.3.1.
note: Pour la différenciation des lymphocytes T, tous les 2 à 3 jours, les cellules dérivées d’iPSC doivent être réensemences avec une nouvelle couche de cellules OP9-DL1-DL4.
- évaluation
- Changements morphologiques des CSPi différenciatrices
- Observez les cellules au microscope à différents jours.
note: Au cinquième jour, les colonies ont des caractéristiques semblables à celles d’un mésoderme, présentant une morphologie classique en forme de fuseau ressemblant aux fibroblastes dermiques humains et une croissance soutenue in vitro. Au 8e jour, de petits amas ronds de cellules commencent à apparaître.
- Analyse des iPSC différenciatrices par cytométrie en flux
- Lors de différents jours de co-culture, analysez les cellules dérivées d’iPSC comme décrit précédemment (Figure 1B,C).
- Analyse fonctionnelle des iPSC différenciatrices
- Au 28e jour de la coculture, prélever les lymphocytes T iPSC-CD8+ des cultures en récoltant les cellules flottantes, trypsiniser les cellules restantes avec de la trypsine à 0,25 %, remettre en suspension dans 8 mL de milieu iPSC, centrifuger pendant 5 min à 400 x g à 15–30 °C, retirer le milieu, puis remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu.
- Conservez les cellules remises en suspension dans une boîte fraîche de 10 cm dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min et assemblez les cellules flottantes. Rincez ensuite les cellules une fois avec un PBS froid.
- Incuber 3 x 10 splénocytes appauvris en cellules T (CD4-CD8-) de rates de souris knock-out H-2 de classe I, HLA-A2.1-transgéniques (HHD) avec un peptide s183 de 5 μM (FLLTRILTI) dans 200 μL de milieu à 4 °C pendant 30 min.
- Produire un mélange de lymphocytes T iPSC-CD8+ avec des splénocytes pulsés avec le peptide s183 (lymphocytes T : splénocytes = 1:4 ; utiliser 0,75 x 106 lymphocytes T). Incuber le mélange de cellules à 37 °C dans un incubateur de CO2 pendant 40 h. Au cours des 7 dernières heures, ajouter 4 μL de bréfeldine A diluée dans la culture (concentration finale de 1 000x, qui sera diluée dans 1x milieu de culture) pour bloquer les processus de transport lors de l’activation cellulaire.
- Colorer les cellules et effectuer une analyse cytométrique en flux de l’interféron-gamma intracellulaire (IFN-γ) comme décrit précédemment (Figure 2).
2. Induction de la réplication du VHB par l’administration hydrodynamique du plasmide du VHB
REMARQUE : la construction pAAV/HBV1.2 a été générée comme décrit précédemment. L’ADN complet du VHB 1.2 est incorporé dans le vecteur pAAV.
- Livraisons hydrodynamiques du plasmide du VHB par la veine de la queue
- Chauffez les souris HHD à l’aide d’une lampe chauffante pendant 5 min dans la cage afin de dilater la veine de la queue.
- Tenez l’animal à l’aide d’une contention et nettoyez les queues de souris avec un spray à 70 % d’éthanol.
- Livraison du plasmide dans le foie.
- Mesurez le poids corporel de la souris à l'aide d'une balance de mesure.
- Diluer 10 μg de plasmide du VHB dans l’équivalent de 8 % de la masse corporelle PBS (p. ex., 1,6 mL pour une souris de 20 g). Chargez le plasmide dilué dans une seringue de 3 ml à l’aide d’une aiguille hypodermique de 26 G × 1⁄2" (0,45 × 12 mm).
- Localisez l’une des deux veines latérales de la queue dans le tiers central de la queue et positionnez l’aiguille dans l’une ou l’autre veine latérale. Administrer l’injection contenant le plasmide du VHB par la veine de la queue dans un délai de 3 à 5 s.
- Quantification de la virémie à partir du sérum sanguin de souris infectées
note: La réplication du VHB se produit du 3e au 35e jour dans le sérum de souris. La réplication de l’ADN atteint son apogée au jour 7 et diminue progressivement. L’ADN du VHB n’est pas éliminé du sérum avant le 35e jour.
- Prélèvement de sérum sanguin de souris infectées
- Prélever environ 0,1 mL de sang dans un tube de microcentrifugation de chaque souris 3, 5, 7 et 10 jours après l’infection par saignement rétroorbitaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, puis incuber à température ambiante (RT) pendant 20 min.
- Centrifuger l’échantillon à 6 000 x g pendant 15 min à 4 °C et recueillir le surnageant sérique après centrifugation.
- Purifiez l'ADN du sérum sanguin à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN disponible dans le commerce en suivant les recommandations du fabricant. Brièvement, lysez les cellules dans une colonne à base de silice, effectuez les lavages et extrayez l’ADN en ajoutant 100 % d’éthanol dans la colonne d’élution et en centrifugant à 6000 x g pendant 1 min. Éluer l’ADN dans 50 μL d’eau exempte de RNase.
- Utilisez 100 ng d’ADN du VHB de l’élution pour une analyse PCR en temps réel. Utilisez les amorces et les sondes suivantes : vers l'avant 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3' ; revers 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3' ; sonde 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
- Utilisez le plasmide contenant le génome du VHB (pAAV/HBV1.2) pour la courbe standard et effectuez une PCR en temps réel dans un volume total de 10 μL (Figure 3).
- Configurez la réaction PCR dans un volume total de 10 μL, comme indiqué dans le tableau 1.
- Configurez le programme PCR dans le thermocycleur, comme indiqué dans le tableau 2. Le taux de transition de température programmé est de 20 °C/s pour la dénaturation/recuit et de 5 °C/s pour l’extension. Mesurez la fluorescence à la fin de la phase de recuit pour chaque cycle pour un suivi PCR en temps réel.
3. Réduction de la réplication du VHB par l’ACT des lymphocytes T iPSC-CD8+ spécifiques de l’Ag viral
- Transfert de cellules adoptives (ACT)
- Différencier les cellules stromales OP9-DL1-DL4 sur les cellules stromales mFlt-3L et mIL-7 pendant 8 jours, comme décrit à la rubrique 1.3.
- Le 22e jour, prélever les lymphocytes T iPSC-CD8+ de la plaque de 10 cm avec de la trypsine, puis laver et remettre en suspension chaque plaque de 10 cm dans 10 ml de milieu frais. Ajoutez les cellules dans une plaque fraîche de 10 cm et retournez-les dans l’incubateur pendant 30 min, comme indiqué au point 1.3. Après 30 min, récupérez les cellules flottantes.
- Utilisez une passoire en nylon de 70 μm pour faire passer les cellules afin d’éliminer les grappes de cellules et de compter le nombre de cellules. Adaptez les cellules à une concentration de 1,5 x 107 cellules/mL dans une solution froide de PBS et utilisez une passoire en nylon de 70 μm pour faire passer les cellules afin d’éliminer à nouveau les grappes de cellules si nécessaire. Gardez les cellules sur la glace jusqu’à l’ACT.
- Injecter une suspension cellulaire de 200 μL (3 x 106 cellules) chez des souris HHD âgées de 4 à 6 semaines par la veine de la queue.
- Induction de la réplication du VHB
- Le 14e jour après le transfert cellulaire, effectuer l’administration hydrodynamique du plasmide HBV par la veine de la queue comme décrit à la rubrique 2.1.
Tableau 1 : Volume de réaction PCR
| Modèle d’ADN | 2 ml |
| Mélange d’hybridation maître d’ADN (ADN polymérase Taq, tampon de réaction PCR, 10 mM MgCl2 et mélange dNTP) | 1 ml |
| 25 mM MgCl2 | 0,8 ml |
| 0,3 μM la sonde | 3 ml |
| 5 μM de chaque amorce | 3,2 ml |
| total | 10 ml |
Tableau 2 : Programme PCR
| dénaturation | Température
95 °C | Temps
5 secondes |
| recuit | 53 °C | 10 secondes |
| extension | 72 °C | 20 secondes |
| 5 °C | |
