Une thérapie cellulaire pour l’arthrite auto-immune dans un modèle murin

Résumé

Source : Haque, M. et al., Développement de cellules T régulatrices spécifiques de l’antigène dérivées de cellules souches contre l’auto-immunité.J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo présente une thérapie cellulaire pour l’arthrite auto-immune chez la souris. Des cellules T régulatrices dérivées d’iPSC exprimant des récepteurs spécifiques de l’ovalbumine sont injectées avec de l’albumine sérique bovine méthylée émulsionnée (mBSA) émulsionnée dans un adjuvant. Les cellules présentatrices d'antigène (CPA) murines traitent et présentent la mBSA aux cellules T, provoquant l'activation et la migration des cellules T vers la membrane synoviale de l'articulation du genou. Les injections subséquentes impliquent de la mBSA seule dans le genou gauche et une combinaison de mBSA et d’ovalbumine dans le genou droit. Dans le genou gauche, la réponse immunitaire à la mBSA déclenche l’arthrite, tandis que dans le genou droit, les cellules T régulatrices interagissant avec l’ovalbumine atténuent l’inflammation, améliorant ainsi les symptômes de l’arthrite.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Maturation in vivo et suppression de l’arthrite auto-immune

1. Générer les constructions à utiliser dans la transduction rétrovirale en sous-clonant les gènes du récepteur des lymphocytes T OT-II (TCR) et de la protéine de boîte à fourche 3 (FoxP3) dans le plasmide MiDR lié au peptide d’auto-clivage 2A pour fabriquer la construction MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
2. Effectuer la transduction rétrovirale de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en utilisant des cellules Plat E comme lignée cellulaire d’emballage.
3. Différenciation in vivo et induction de l’arthrite chez la souris.
   1. Différencier les iPSC transduites par OT-II TCR/FoxP3 (OT-II-FoxP3/iPSCs), les iPSC transduites par FoxP3 et les iPSC transduites par DsRed sur les cellules stromales OP9-DL1-DL4-I-A^b en présence des cytokines mFlt-3L et mIL-7 pendant 8 jours.
   2. Le jour 0, ensemencer les cellules^B OP9-DL1-DL4-I-A à une densité minimale de 10⁴ cellules/^cm2 à l’aide d’un milieu OP-9 (milieu α-MEM contenant 20 % de sérum de veau fœtal (SCF) et 2,2 g/L de bicarbonate de sodium. Assiette 1 x 10⁶ cellules par plat de 10 cm.
   3. Le jour 3, lorsque les cellules^B OP9-DL1-DL4-I-A deviennent confluentes à 80-90 %, retirez le milieu et ensemencez 0,5 - 1 x 10^{cellules B 5} sur les^{cellules B} OP9-DL1-DL4--I-A dans le milieu OP-9.
      REMARQUE : Cette méthode établit la co-culture d’iPSC sur les cellules^b OP9-DL1-DL4-I-A et est considérée comme le jour 0 de la différenciation.
   4. Le jour 5, retirez le milieu de la boîte de 10 cm par aspiration, lavez les cellules avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et aspirez le PBS. Ajouter 4 ml de trypsine à 0,25 % et incuber à 37 °C pendant 10 min. Ajoutez encore 8 ml de milieu iPSC dans les cellules, remettez-les en suspension et centrifugez à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
      1. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 ml de milieu iPSC. Incuber ces cellules remises en suspension sur une parabole fraîche de 10 cm et retourner dans l’incubateur pendant 30 min.
         REMARQUE : Retirez les cellules d’alimentation OP9-DL1-DL4-I-A^b et conservez les iPSC différenciateurs dans le support. Maintenir les lymphocytes^B OP9-DL1-DL4-I-A en continu pour atteindre une confluence de 80 à 90 % pour une co-culture ultérieure.
      2. Après 30 minutes, collectez les cellules flottantes, filtrez-les à travers une crépine cellulaire de 70 μm et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre.
   5. Amorcez 5 x 10⁵ d’iPSC dans un confluent frais de 80 à 90 % de cellules^B OP9-DL1-DL4-I-A dans un milieu OP9. Compléter le milieu avec du mFlt-3L à une concentration finale de 5 ng/ml.
   6. Trypsinisez les trois types de cellules de la plaque de 10 cm et suspendez à nouveau les cellules de chaque plaque de 10 cm dans 10 ml de milieu frais. Ajouter les cellules dans une assiette fraîche de 10 cm et remettre dans l’incubateur pendant 30 min. Après 30 min, récupérez les cellules flottantes.
   7. Passez les cellules dans une passoire cellulaire de 70 μm pour éliminer les amas de cellules et compter à l’aide d’un hémocytomètre. Ajustez les cellules à une concentration de 1,5 x 10⁷ cellules/ml dans du PBS froid et filtrez à nouveau si nécessaire. Gardez les cellules sur de la glace jusqu’à ce que les cellules adoptives soient transférées chez la souris.
   8. Injecter 200 μl de suspension cellulaire (3 x 10⁶ cellules) dans trois groupes différents de souris femelles C57BL/6 âgées de 4 à 6 semaines par la veine de la queue.
   9. Le 10e jour, après le transfert cellulaire, injectez à des souris 100 μg d'albumine sérique bovine méthylée (mBSA) émulsionnée dans l'adjuvant complet de Freund à la base de la queue à l'aide d'une seringue de 1 ml.
   10. Le 17e jour, anesthésez les souris à l’aide d’un vaporisateur d’isoflurane. Utilisez 4 à 5 % d’isoflurane pour l’induction et 1 à 2 % pour l’entretien. Induire l’arthrite par injection intra-articulaire de 20 μg de mBSA dans 10 μl de PBS dans l’articulation du genou gauche et de 20 μg de mBSA et de 100 μg d’ovalbumine entière (OVA) dans 10 μl de PBS dans l’articulation du genou droit. De la nourriture et un pack de gel peuvent être placés sur le sol de la literie après l’apparition de l’arthrite. Les souris seront euthanasiées : score d’état corporel (BCS) de 2/5 ou moribond, cachexie sévère et/ou décubitus persistant (une période de 24 heures) et score de gravité de 4. Dans le score 4, un érythème et un gonflement sévère englobent la cheville, pied, et les doigts, ou ankyloses du membre.
4. Caractérisation des iPSC transduits OT-II TCR/FoxP3.
   1. Utilisez un microscope fluorescent (20X) pour visualiser les cellules DsRed⁺ GFP⁺ vivantes non fixées.
   2. Examiner l’intégration et l’expression des gènes par transfert Western et cytométrie en flux.
5. Dosage de suppression de l’arthrite
   1. Mesurez l’enflure des deux genoux des souris avant l’induction de l’arthrite à l’aide d’un pied à coulisse pour établir une ligne de base.
   2. Suivez les étapes (1.3.1 - 1.3.10) pour l’induction de l’arthrite et le transfert de Treg. Mesurez les genoux de la souris à l’aide d’un pied à coulisse post-transfert Treg.
   3. Calculez le pourcentage d’augmentation du diamètre du genou : Pourcentage d’augmentation = (Diamètre du genou le jour 1 - Diamètre du genou le jour 0) / Diamètre du genou le jour 0.
6. Mesure de la destruction articulaire et de l’infiltration de cellules inflammatoires dans les genoux par histologie (Figure 1).
   1. Le 7e jour après l’induction de l’arthrite, euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone (CO₂) suivie d’une luxation cervicale. Retirez les poils des genoux à l’aide d’une tondeuse électrique et excisez les genoux par intervention chirurgicale.
   2. Retirez la peau des jambes en faisant une incision dans la patte arrière avec des ciseaux à bout émoussé et coupez la peau à travers la cuisse et jusqu’à la cheville. Pelez doucement la peau sur la jambe et le pied pour exposer le muscle. Retirez le muscle de la jambe avec précaution sans endommager l’articulation du genou.
      1. Coupez la patte arrière juste au-dessus de l’articulation pelvienne/hanche et coupez le tibia à l’aide de ciseaux de dissection tranchants.
   3. Fixez les genoux avec du formol à 4 % pendant 48 h. Détartrez les genoux à l’aide d’acide formique 2,5 M, rincez trois fois au xylène pendant 3 minutes, rincez deux fois à l’éthanol à 100 %, rincez deux fois à l’éthanol à 95 %, rincez deux fois à l’eau déminéralisée pendant 2 minutes et détartrez à 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Traiter à une température inférieure à l’ébullition (90 °C) pendant 20 min.
   4. Retirez les deux genoux, fixez-les dans du formol à 10 % et calcifiez-les dans du Formical-4. Enfoncer les tissus dans de la paraffine, sectionner à 4 μm, et colorer à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) ou à la safranine O et observer au microscope.

Résultats

Figure 1 : Le transfert adoptif d’iPSC-Tregs spécifiques à l’Ag améliore l’AIA chez la souris. Des iPSC murins ont été transduits avec la construction rétrovirale MiDR, MiDR-FoxP3 ou MiDR-TCR-FoxP3 et ont été co-cultivés sur les lymphocytes^b OP9-DL1/DL4/I-A. Le jour 7, les cellules transduites par le gène (3 × 10⁶/souris) ont été transférées adoptivement ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris C57BL/6j	Laboratoire Jackson	664
α-MEM	Invitrogen	Référence A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Polybrène	sigma	107689
Genejammer	Science intégrée	Référence 204130
mFlt-3L	Peprotech	250 à 31 L
mIL-7	Peprotech	217-17
mBSA	sigma	A7906
Albumine d’ovules	Avantor	Référence 0440-01
CFA	Difco	2017014
Dispositif de retenue du tailveiner	Braintree scientifique	RTV 150-STD
paraformaldéhyde	sigma	P6148-500G	Attention : Allergène, Carcénogène, Toxique