Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Splénectomie et préparation des lymphocytes T
Jour 0 :
- Versez 10 ml de milieu cellulaire T (MTC) dans un cône de 50 ml et placez-le sur de la glace pour le prélèvement de la rate.
- Sacrifiez le nombre approprié d’animaux par asphyxie au CO2 et décapitation secondaire : Placez les animaux dans une cage recevant du CO2 à un débit de 10 à 30 % du volume de la cage par minute, conformément aux directives de l’American Veterinary Medical Association (pas plus de 5 animaux peuvent être sacrifiés simultanément) jusqu’à ce que la respiration cesse, puis pendant deux minutes. Retirez les animaux de la chambre de CO2 et décapitez-les.
note: La rate d’une souris C57BL/6 femelle âgée de 6 à 12 semaines produira environ 4,5 à 5 x 107 splénocytes. Ici, 4 rates seront prélevées pour environ 200 x 106 cellules.
- Posez la souris de manière à ce que son côté droit soit tourné vers le haut et vaporisez de l’éthanol à 70 %. À l’aide de la pince, saisissez un mince pli de peau sous la cage thoracique gauche et faites une légère incision avec les ciseaux. Pelez la peau, saisissez soigneusement un mince pli du péritoine avec une pince et coupez une petite cavité.
- La rate est un petit organe allongé et rouge foncé qui ressemble à un haricot aplati ; saisissez délicatement la rate avec la pince et excisez en coupant le tissu conjonctif environnant. Placez les rates excisées dans le cône contenant 10 ml de MTC sur de la glace.
- Verser les rates sur une crépine à mailles de 70 m et désagréger en les écrasant avec l’extrémité émoussée de l’intérieur d’une seringue de 5 ml pour générer une suspension unicellulaire. Un maximum de deux rates doit être désagrégé par crépine à mailles.
- Utilisez un petit volume de TCM pour laver soigneusement la passoire après la désagrégation afin de recueillir les splénocytes restants. Regroupez toutes les rates désagrégées dans une suspension unicellulaire. Porter le volume final à 50 ml avec TCM pour un lavage et essorer à 300 x g pendant 10 min.
- Préparez une solution de 1x tampon de lyse en ajoutant 5 ml de tampon de lyse 10x à 45 ml d’eau stérile. Pour éliminer les globules rouges, remettre la pastille en suspension dans 5 ml de 1x tampon de lyse par rate dans un cône de 50 ml, en mélangeant bien en pipetant doucement de haut en bas. Si vous dépassez 5 rates, utilisez un tube à centrifuger de 250 ml. Placez le tube conique ou centrifuge dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min.
- Retirez la réaction de lyse du bain-marie et ajoutez de la TCM dans un rapport de 1:1 avec un tampon de lyse pour neutraliser la réaction. Laver en essorant à 300 x g pendant 10 min.
- Aspirer le surnageant et remettre complètement en suspension la pastille dans la MTC (2 ml/rate, 8 ml au total pour 4 rates) par pipetage de haut en bas.
- Compter les cellules en ajoutant 10 μl de suspension cellulaire à 190 μl de bleu trypan (dilution 1:20). Multipliez le nombre obtenu dans l’un des quatre carrés quadragés par 20 x 104 x volume total (8 ml) pour obtenir le nombre total de cellules (par exemple, 125 cellules x 20 x 104 x 8 ml = 200 x 106 splénocytes).
- Diluer les cellules à une concentration de 2 x 106 cellules/ml dans la MTC, complétées par 2 μg/ml de concanavaline A (ConA) et 50 UI/ml d’interleukine-2 humaine recombinante (rhIL-2). Ainsi, pour 200 x 106 splénocytes, ajoutez 92 ml de milieu à 8 ml de cellules, 200 μg de ConA et 5 000 UI de rhIL-2.
- Ajouter 2 mL de cellules dans chaque puits de 24 boîtes traitées pour culture tissulaire, de sorte que 4 x 106 cellules se trouvent dans chaque puits (p. ex., 100 ml de cellules nécessiteront environ 4 plaques).
- Incuber toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.
2. Transduction
Jour 1 :
- Calculez le nombre de plaques à 24 puits non traitées par culture tissulaire nécessaires à la transduction en multipliant le nombre de rates prélevées par 2 (8 plaques sont nécessaires pour 4 rates).
- Ensuite, calculez le volume requis de solution de fragments de fibronectine humaine recombinante (RHFF) nécessaire pour enrober les plaques en multipliant (nombre total de puits + 3) x 0,5 ml (8 plaques x 24 puits = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
- Préparer 97,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant du RHFF à une concentration de 25 μg/ml en multipliant le volume total par 25 μg (97,5 x 25 = 2437,5 μg). Ajoutez cette quantité de RHFF à 97,5 ml de PBS.
- Enduisez les plaques de 24 puits non traitées par culture tissulaire en ajoutant 0,5 ml de solution PBS/RHFF par puits.
- Incuber toute la nuit à 4 °C.
Jour 2 :
- Videz la solution PBS/RHFF à partir de plaques de 24 puits non traitées par culture tissulaire.
- Ajouter 1 ml/puits 2 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Retirez le BSA en renversant fermement la plaque. Laver en ajoutant 2 ml de PBS.
- Prélever le surnageant viral en transférant le milieu de chaque plaque enrobée de 293T (HEK293T)-poly-D-lysine (PDL) dans un tube à centrifuger de 250 ml et faire tourner 10 min à 500 x g.
- Transférez avec précaution le surnageant viral dans un tube à centrifuger frais de 250 ml, en veillant à ne pas perturber la pastille cellulaire qui peut s’être formée.
- Ajouter de la MTC fraîche au surnageant viral de sorte que le volume final soit de 3 ml de plus que la quantité nécessaire pour les puits enrobés de RHFF. Par exemple, pour 192 puits recouverts de RHFF, porter le volume de surnageant viral à 192 + 3 ml = 195 ml.
- Retirez les splénocytes cultivés de l’incubateur et remettez-les en suspension en pipetant doucement de haut en bas 2 à 3 fois dans chaque puits. Transférer dans un conique de 250 ml. Si vous utilisez une pipette multicanaux, l’utilisation d’un réservoir stérile avant le transfert aidera à accélérer cette étape. Comptez comme décrit précédemment et tournez à 300 x g pendant 10 min.
- Ajouter de l’interleukine-2 humaine recombinante (rhIL-2) au surnageant viral à une concentration de 50 UI/ml. Par exemple, ajoutez 50 x 195 = 9 750 UI de rhIL-2 à 195 ml de surnageant viral.
- Mettre en suspension les splénocytes dans le surnageant viral à 1 x 106 cellules/ml
- Ajouter 1 ml/puits de suspension de splénocytes dans des plaques à 24 puits recouvertes de RHFF.
- Essorage pendant 90 min selon les réglages suivants : 770 x g, accélération = 4, frein/décélération = 0, 32 °C.
- Préparez une solution de MTC avec 50 UI/ml de rhIL-2. Par exemple, préparez une solution de 200 TCM en ajoutant 10 000 UI de rhIL-2. Ajouter 1 ml de rhIL-2/TCM dans chaque puits après centrifugation.
- Culture une nuit à 37 °C dans 5 % de CO2.
3. Culture et récolte de cellules CAR-T
Jours 3 et 4 :
- Si les lymphocytes T atteignent une confluence de >80 %, les cellules peuvent être divisées (cela se produit généralement au jour 3 ou au jour 4). Pour diviser les cellules, il faut doucement faire pipier de haut en bas dans chaque puits 2 à 3 fois, et déplacer 1 ml de chaque puits dans de nouveaux puits d’une plaque fraîche traitée à 24 puits traitée par culture tissulaire. Ensuite, ajoutez 1 ml de MTC fraîche avec 50 UI/ml d’IL-2 dans chaque puits de sorte que le volume final soit de 2 ml dans tous les puits.
- Si les cellules n’atteignent pas >80 % de confluence, effectuez un changement de demi-média en pipetant lentement 1 ml de média du haut de chaque puits. Évitez de déranger les cellules déposées sur le fond lors du retrait du support. Ajouter 1 ml de MTC fraîche contenant 50 UI/ml de rhIL-2.
Jour 5 :
- Remettre en suspension les cellules CAR-T en les pipetant doucement de haut en bas 3 fois dans chaque puits et les transférer dans un tube à centrifuger de 250 ml. Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 10 min.
- Surnageant à aspiration complète sans déranger les granulés. Lavez une fois avec du PBS, comptez les cellules comme décrit précédemment et lavez-vous une deuxième fois avec du PBS. Le rendement typique d’une cellule CAR-T est d’environ 1 x 106 cellules par puits (8 plaques x 24 puits = 192 x 106 cellules CAR-T).
- Remettre en suspension des cellules dans du PBS à une concentration de 5 x 107/ml pour une injection de 1 x 107 dans un volume de 200 μg (par exemple, pour 192 x 10cellules CAR T 6, remettre en suspension la pastille lavée dans 3,84 ml de PBS).
