Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut. Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Expansion non spécifique des lymphocytes T effecteurs cytotoxiques
- Préparer et irradier les cellules nourricières à 35 Gy. Pour la stimulation de 2 x 105 - 4 x 105 cellules effectrices, préparez 10 x 106 cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et 1 x 106 lignées cellulaires lymphoblastoïdes B (BLCL) à partir de trois donneurs sains distincts.
- Remettre en suspension les cellules nourricières et les cellules effectrices dans 15 mL de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, de pénicilline (100 UI/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL) et 300 UI/mL d’interleukine-2 recombinante (IL-2).
- Ajouter de la phytohémagglutinine (PHA-L) à une concentration finale de 1 μg/mL, mélanger soigneusement et distribuer 150 μL de suspension cellulaire par puits dans des plaques à fond en U à 96 puits.
- Incuber à 37 °C et avec 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée.
- Vérifiez quotidiennement la plaque jusqu’à ce que de gros amas de cellules se forment dans les puits de culture (~jour 7).
- Transvaser les cellules dans une fiole de culture à raison de 1 x 106 cellules/mL dans un milieu de culture frais.
- Déterminer le nombre total de cellules en comptant (2 fois par semaine) et les maintenir à 1 x 106 cellules/mL dans un milieu de culture frais.
note: Les cellules immunitaires effectrices doivent être prêtes pour l’administration thérapeutique à l’état de repos (généralement 3 semaines après le stimulus d’amplification initial). La pureté et la réactivité de ces cellules effectrices doivent être vérifiées avant les injections in vivo (par exemple, avec des tests in vitro).
2. Préparation préopératoire des cellules effectrices
- Après avoir vérifié le nombre de cellules effectrices, prélever les cellules effectrices dans un tube de 50 mL par centrifugation (300 x g pendant 5 min).
note: Pour compenser toute perte, préparez un excès de cellules (par exemple, 50 x 106).
- Retirer délicatement le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 15 mL de PBS stérile et centrifuger pendant 5 min à 300 x g pour effectuer le lavage.
- Retirer soigneusement et complètement le surnageant, puis remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS stérile.
- Transvaser les cellules remises en suspension dans un microtube de 1,5 mL pour une centrifugation à 300 x g pendant 5 min.
- Retirez soigneusement et complètement le surnageant en le pipetant lentement.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 8 μL de PBS stérile par souris.
note: Il s’agit d’une étape cruciale.
- Mesurez le volume de la suspension cellulaire à l’aide d’une micropipette. Si nécessaire, ajoutez du PBS stérile (20 x 106 cellules dans 15 μL de PBS par dose) et mélangez soigneusement.
- Vérifier, à l’aide d’une micropipette, que le volume final par souris est compris entre 15 et 20 μL (impérativement < 20 μL).
- Maintenir les cellules sur glace jusqu’à l’injection stéréotaxique.
note: Plus de 3 h n’ont pas été testés.
3. Injection stéréotaxique
- Configuration de l’équipement
- Assemblez et calibrez un cadre stéréotaxique pour petits animaux selon les instructions du fabricant afin d'assurer l'exactitude des injections intracrâniennes (p. ex., taille de la seringue, volume souhaité et taux d'injection).
note: Un débit de perfusion lent est recommandé (c’est-à-dire 2 à 3 μL/min).
- Installez le matériel sous une enceinte de sécurité microbienne (CSM) pour maintenir la stérilité des instruments et protéger les souris contre les infections.
note: Placez les « blocs isothermes » dans un bain-marie à 37 °C. Ce système limite l’hypothermie des souris pendant la chirurgie. Les coussins chauffants, qui sont nécessaires pour les soins post-opératoires, doivent être utilisés pendant la surveillance continue de la température.
- Préparation préopératoire de l’animal
- Anesthésier une souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (10 mg/mL) et de xylazine (0,1 mg/mL) à 10 μL/g du poids corporel de la souris.
- Effectuez un test de pincement des orteils pour assurer l’anesthésie et l’analgésie complètes de l’animal.
note: Tout mouvement est une indication d’analgésie non profonde et, si cela se produit, quelques minutes de plus sont nécessaires avant de répéter l’opération.
- Une fois la souris correctement anesthésiée, utilisez des ciseaux pour retirer la fourrure du site chirurgical (entre les deux oreilles, jusqu’au nez).
- Préparation cellulaire préopératoire
- Remettez soigneusement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette (plusieurs fois) avant chaque injection pour éviter tout agglutination des cellules.
- Aspirez avec précaution le volume de suspension cellulaire requis (15 à 20 μL) dans la microseringue 22-G pour éviter l’aspiration de bulles.
note: Cette étape de chargement des cellules dans la microseringue est importante pour minimiser les variations dans les volumes injectés. Rechargez les cellules pour chaque injection individuelle entre les procédures afin d’éviter tout agglutination cellulaire et d’assurer l’administration d’un nombre pair de cellules effectrices dans la cohorte.
- Ensuite, placez la seringue dans le pousse-seringue adapté.
- Soins procéduraux
- Désinfectez le site chirurgical avec des écouvillons imbibés d’une solution de povidone iodée à 5 % au moins 3 fois.
- Placez une pommade ophtalmique lubrifiante dans les yeux de la souris pour éviter tout dessèchement des cornées.
- Positionnez la souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique, sur un bloc isotherme chaud recouvert d'une pellicule plastique stérile pour maintenir la température de la souris pendant l'intervention et limiter la mortalité.
note: Le nez et les dents de la souris doivent être positionnés de manière appropriée au-dessus de la barre dentaire, afin d'assurer une circulation respiratoire adéquate pendant la procédure.
- Une fois la souris positionnée au-dessus de la barre dentaire, serrez fermement les barres d'oreille sous les oreilles de la souris pour immobiliser la tête.
note: Veillez à ne pas endommager les tympans ou à ne pas compromettre la respiration.
- Faites une incision cutanée sagittale médiane de 1 à 2 cm avec des ciseaux stériles le long de la partie supérieure du crâne de l’avant vers l’arrière pour exposer le crâne.
- Identifier l’intersection des sutures sagittale et coronale (Bregma) pour servir de repères pour la localisation stéréotaxique avant l’injection (illustré à la figure 1).
- Placez la microseringue au-dessus de ce point.
- Déplacez la microseringue de 2 mm vers la droite sur le côté et de 0,5 mm vers l’avant du Bregma.
- À l’aide d’une microperceuse, faites un petit trou dans le crâne avec un foret stérile à des coordonnées prédéterminées. Attention à rester superficiel afin d’éviter toute lésion traumatique du cerveau.
note: Dans ce protocole, des cellules immunitaires ont été injectées dans une tumeur établie (une semaine après l’injection de cellules tumorales). La peau doit être rouverte (cicatrice) et l’injection doit être réalisée aux mêmes coordonnées que celles utilisées pour l’implantation des cellules tumorales (le trou est généralement encore présent jusqu’à 2 semaines après l’injection). Les coordonnées ont été sélectionnées pour l’injection de cellules tumorales et effectrices dans le parenchyme cérébral.
- Injection de cellules effectrices immunitaires
- Insérez soigneusement la microseringue dans le trou percé et, en vous déplaçant lentement, avancez l’aiguille de 3 mm vers le bas dans la dure-mère, puis reculez de 0,5 mm jusqu’à une profondeur finale de 2,5 mm avant d’injecter les cellules effectrices.
- Exécutez l’injection de cellules effectrices à 2 - 3 μL/min et surveillez les souris tout au long du temps d’injection.
- Une fois l’injection terminée, retirez l’aiguille sur seulement 1 mm et maintenez la microseringue en place pendant une minute supplémentaire avant de retirer lentement et complètement la microseringue, afin d’éviter toute fuite du site de perfusion.
note: Après avoir retiré l’animal du dispositif stéréotaxique, nettoyez immédiatement le matériel d’injection pour les expériences à venir.
- Soins postopératoires et suivi de la souris
- Retirer l’animal du cadre stéréotaxique et appliquer immédiatement une solution de povidone iodée à 5 % sur le site d’incision et fermer la peau avec une suture chirurgicale appropriée.
- Appliquez un gel de lidocaïne à 2 % directement sur la plaie et administrez 0,15 μg/g de buprénorphine par injection sous-cutanée pour l’analgésie post-opératoire.
- Replacez la souris anesthésiée dans sa cage au-dessus d’un coussin chauffant réglé à 37 °C pour maintenir une température corporelle appropriée et éviter toute hypothermie.
note: Un logement séparé n’est pas nécessaire.
- Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie et transférez-la dans une pièce de logement.
note: À ce jour, ce protocole est bien étayé car peu de complications imprévues sont survenues (< 5 % des souris injectées).
- Surveillez quotidiennement les souris et euthanasiez-les lorsque des signes de détérioration de la santé sont observés (p. ex., posture voûtée, mobilité réduite, prostration ou perte de poids corporelle importante [≥ 15 %]).
