1. Production de cellules CART19
- Isolement, stimulation et culture ex vivo de lymphocytes T
- Effectuer tous les travaux de culture cellulaire dans une hotte de culture cellulaire en utilisant l’équipement de protection individuelle approprié. Récoltez des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de cônes de sang de donneur normal anonymisés prélevés lors de l’aphérèse, car on sait qu’elles constituent une source viable de PBMC.
- Pour isoler les PBMC, ajoutez 15 mL d’un milieu à gradient de densité dans un tube de séparation à gradient de densité de 50 mL. Diluez le sang du donneur avec un volume égal de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) pour éviter le piégeage des cellules.
- Ajoutez le sang dilué du donneur du cône dans le tube de séparation, en prenant soin de ne pas perturber l’interface entre le sang et le milieu à gradient de densité. Centrifugeuse à 1 200 x g pendant 10 min à RT.
- Décanter le surnageant dans un nouveau contenant conique de 50 mL, laver avec PBS + 2 % FBS en portant jusqu’à 40 mL, centrifuger à 300 x g pendant 8 min à RT, aspirer le surnageant, remettre en suspension dans 40 mL de tampon et compter les cellules.
- Isolez les lymphocytes T des PBMC à l'aide d'un kit de billes magnétiques à sélection négative à l'aide d'un séparateur de cellules entièrement automatisé selon le protocole du fabricant.
- Pour cultiver les lymphocytes T isolés, préparez un milieu de cellules T (MTC) composé de 10 % de sérum AB humain (v/v), de 1 % de pénicilline-streptomycine-glutamine (v/v) et d’un milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum. Stérilisez le milieu en le filtrant à travers un filtre à vide stérile de 0,45 μm, puis à l’aide d’un filtre à vide stérile de 0,22 μm.
- Le jour 0 (le jour de la stimulation des lymphocytes T), lavez les billes CD3/CD28 avant de stimuler les lymphocytes T. Pour le lavage, placez le volume requis de billes (utilisez suffisamment de billes CD3/CD28 pour un rapport de 3:1 billes : cellules T ; notez que la concentration des billes peut être variable) dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL et remettre en suspension dans 1 mL de MTC.
- Mettre en contact avec un aimant.
- Au bout de 1 min, aspirez le TCM et mettez-le en suspension dans 1 mL de TCM frais pour laver les billes.
- Répétez cette procédure pour un total de trois lavages.
- Après le troisième lavage, remettre les billes en suspension dans 1 mL de TCM.
- Comptez les lymphocytes T.
- Transférez les billes dans les cellules T dans un rapport de 3:1 perles :cellules.
- Diluer les cellules à une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.
- Incuber à 37 °C, 5 % CO2 pendant 24 h.
- Transfection et transduction des lymphocytes T
- Effectuer les travaux lentiviraux en utilisant les précautions BSL-2+, y compris les cagoules de culture cellulaire, l’équipement de protection individuelle et la désinfection des matériaux usagés avec de l’eau de Javel avant de les éliminer.
- Acquérir une construction de récepteur antigénique chimérique-T19 (CART19) dans un vecteur lentiviral.
note: La construction CART19 utilisée ici a été conçue puis synthétisée de novo à l’aide d’un fournisseur de synthèse de protéines disponible dans le commerce. La construction CAR a ensuite été clonée dans un lentivirus de troisième génération sous le contrôle d’un promoteur EF-1α. Le fragment de région variable à chaîne unique est dérivé du clone FMC63 et reconnaît le CD19 humain. La construction CAR19 possède un domaine de costimulation 4-1BB de deuxième génération et une stimulation CD3ζ (FMC63-41BBz).
- Effectuer la production de lentiviraux comme décrit précédemment.
- En bref, pour produire un lentivirus, utilisez 293 cellules T qui ont atteint une confluence de 70 à 90 %.
- Laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante les réactifs de transfection, y compris 15 μg du plasmide lentiviral d’intérêt, 18 μg d’un vecteur d’emballage gag/pol/tat/rev, 7 μg d’un vecteur d’enveloppe VSV-G, 111 μL du réactif de pré-complexation, 129 μL du réactif de transfection et 9,0 mL du milieu de transfection avant de les ajouter aux cellules 293T. Cultivez ensuite les cellules transfectées à 37 °C, 5 % de CO2.
- Récolte, centrifugation (900 x g pendant 10 min), filtre (filtre en nylon 0,45 μM) et concentré surnageant à 24 et 48 h par ultracentrifugation à 13 028 x g pendant 18 h ou 112 700 x g pendant 2 h.
- Congeler à -80 °C pour une utilisation future.
- Le jour 1, remettre doucement en suspension les cellules T pour briser les rosettes des cellules T qui avaient été stimulées à 1 x 106/mL le jour 0.
- En prenant les précautions appropriées contre la BSL-2+ pour tous les tests lentiviraux, ajouter le virus récolté frais ou congelé aux lymphocytes T stimulés à une multiplicité d’infection (MOI) de 3,0.
- Expansion des cellules CAR-T
- Pendant la phase d’expansion, continuez à incuber les lymphocytes T transduits à 37 °C, 5 % CO2. Compter les cellules CAR-T les jours 3 et 5, et ajouter de la MTC fraîche et préchauffée à la culture pour maintenir une concentration de cellules CAR-T de 1 x 106/mL.
- Retirez les billes des lymphocytes T transduits 6 jours après la stimulation (jour 6) à l’aide d’un aimant. Récoltez, mettez en suspension et placez les lymphocytes T dans des tubes coniques de 50 ml dans un aimant pendant 1 min. Récupérez ensuite le surnageant (qui contient les cellules CAR-T) et jetez les billes.
- Remettez en culture les cellules CAR-T collectées à une concentration de 1 x 106 cellules/mL pour reprendre l’expansion.
- Le jour 6, évaluer l’expression de surface du CAR par cytométrie en flux.
note: Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour détecter l’expression superficielle de CAR, telles que la coloration avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris (H+L) de chèvre adsorbé ou par coloration avec un peptide spécifique de CD19, conjugué à un fluorochrome. Ici, prélevez une aliquote (environ 100 000 lymphocytes T) de la culture et lavez-la avec un tampon d'écoulement préparé avec de la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, 2 % de sérum de veau fœtal et 1 % d'azoture de sodium. Colorez les cellules avec l’anticorps anti-CAR et lavez-les deux fois. Colorez les cellules avec une coloration vivante/morte et un anticorps monoclonal CD3 (OKT3). Lavez les cellules et remettez-les en suspension dans le tampon d’écoulement. Acquisition sur un cytomètre pour déterminer l’efficacité de la transduction.
- Cryoconservation par cellules CAR-T
- Pour récolter et cryoconserver les cellules CAR-T 8 jours après la stimulation (jour 8 de l’expansion des cellules T), récoltez les cellules de la culture.
- Faites tourner pendant 5 min à 300 x g.
- Remettre en suspension dans le milieu de congélation à raison de 10 millions de cellules par mL par flacon dans un milieu de congélation composé de 10 % de diméthylsulfoxyde et de 90 % de sérum de veau fœtal.
- Congeler dans un récipient de congélation pour atteindre un taux de refroidissement de -1 °C/min dans un congélateur à -80 °C, puis transférer à l’azote liquide après 48 h.
- Avant de les utiliser pour des expériences in vitro ou in vivo, décongeler les cellules CAR-T dans la MTC chaude.
- Lavez les cellules pour diluer et éliminer le diméthylsulfoxyde et remettez en suspension à une concentration de 2 x 106 cellules/mL dans de la MTC chaude. Repos une nuit à 37 °C, 5 % CO2.
2. Production de CART19 en facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF k/o)
- Pour perturber le GM-CSF, utilisez un ARN guide (ARNg) ciblant l’exon 3 du GM-CSF humain (CSF2) sélectionné via le criblage des ARNg précédemment signalés comme ayant une efficacité élevée pour le gène CSF2 qui code pour la cytokine humaine GM-CSF.
note: Une construction lentivirale de troisième génération Cas9 de troisième génération synthétisée commercialement et contenant cet ARNg (sous un promoteur U6) a été utilisée. La construction contient un gène de résistance à la puromycine. La séquence de l’ARNg est GACCTGCCTACAGACCCGCC.
- Pour produire un lentivirus, utilisez des cellules 293T qui ont atteint une confluence de 70 à 90 %.
- Laisser incuber 15 μg du plasmide lentiviral d’intérêt, 18 μg d’un vecteur d’emballage gag/pol/tat/rev, 7 μg d’un vecteur d’enveloppe VSV-G, 111 μL du réactif de pré-complexation, 129 μL du réactif de transfection et 9,0 mL du milieu de transfection pendant 30 min à température ambiante.
- Ajoutez des réactifs de transfection aux cellules 293T. La culture à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
- Récolte, centrifugation (900 x g pendant 10 min), filtre (filtre en nylon de 0,45 μM) et concentration du surnageant à 24 et 48 h par ultracentrifugation à 13 028 x g pendant 18 h ou 112 700 x g pendant 2 h et congélation à -80 °C pour une utilisation future.
- Le jour 1, remettez doucement les cellules T en suspension pour briser les rosettes.
- Dans un laboratoire approuvé BSL-2+, ajoutez un virus congelé ou fraîchement récolté aux cellules T stimulées pour générer des cellules CAR-T. Transduisez les lymphocytes T avec le lentivirus CAR19 et le lentivirus GM-CSF ciblant le lentivirus CRISPR. Ajouter le lentivirus CAR19 à un moment d’inertie de 3. Étant donné qu’il n’était pas possible de titrer le lentivirus CRISPR, utilisez des particules virales générées à partir d’une préparation plasmidique de 15 μg pour transduire 10 x 10cellules 6 T.
- Voir les étapes restantes de la stimulation, de l’expansion et de la cryoconservation des lymphocytes T, comme indiqué à l’étape 1.
- Pour les lymphocytes T modifiés par lentiCRISPR présentant une résistance à la puromycine, traiter les cellules avec du dichlorhydrate de puromycine à une concentration de 1 μg de puromycine par 1 mL le jour 3 et le jour 5.
