Modification génétique des cellules CAR-T à l’aide d’un système CRISPR-Cas9

Résumé

Source : Sterner, R. M. et al., Utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer le GM-CSF dans les cellules CAR-T.J. Vis. Exp. (2019)

La vidéo décrit un processus de création de cellules CAR-T génétiquement modifiées par le biais du système CRISPR-Cas9. L’infection des lymphocytes T par des lentivirus CRISPR et CAR entraîne des modifications du gène cible et la synthèse d’un récepteur antigénique chimérique ou CAR, conduisant finalement à la formation de cellules CAR-T génétiquement modifiées.

Protocole

1. Production de cellules CART19

1. Isolement, stimulation et culture ex vivo de lymphocytes T
   1. Effectuer tous les travaux de culture cellulaire dans une hotte de culture cellulaire en utilisant l’équipement de protection individuelle approprié. Récoltez des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de cônes de sang de donneur normal anonymisés prélevés lors de l’aphérèse, car on sait qu’elles constituent une source viable de PBMC.
   2. Pour isoler les PBMC, ajoutez 15 mL d’un milieu à gradient de densité dans un tube de séparation à gradient de densité de 50 mL. Diluez le sang du donneur avec un volume égal de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) pour éviter le piégeage des cellules.
      1. Ajoutez le sang dilué du donneur du cône dans le tube de séparation, en prenant soin de ne pas perturber l’interface entre le sang et le milieu à gradient de densité. Centrifugeuse à 1 200 x g pendant 10 min à RT.
      2. Décanter le surnageant dans un nouveau contenant conique de 50 mL, laver avec PBS + 2 % FBS en portant jusqu’à 40 mL, centrifuger à 300 x g pendant 8 min à RT, aspirer le surnageant, remettre en suspension dans 40 mL de tampon et compter les cellules.
   3. Isolez les lymphocytes T des PBMC à l'aide d'un kit de billes magnétiques à sélection négative à l'aide d'un séparateur de cellules entièrement automatisé selon le protocole du fabricant.
   4. Pour cultiver les lymphocytes T isolés, préparez un milieu de cellules T (MTC) composé de 10 % de sérum AB humain (v/v), de 1 % de pénicilline-streptomycine-glutamine (v/v) et d’un milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum. Stérilisez le milieu en le filtrant à travers un filtre à vide stérile de 0,45 μm, puis à l’aide d’un filtre à vide stérile de 0,22 μm.
   5. Le jour 0 (le jour de la stimulation des lymphocytes T), lavez les billes CD3/CD28 avant de stimuler les lymphocytes T. Pour le lavage, placez le volume requis de billes (utilisez suffisamment de billes CD3/CD28 pour un rapport de 3:1 billes : cellules T ; notez que la concentration des billes peut être variable) dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL et remettre en suspension dans 1 mL de MTC.
   6. Mettre en contact avec un aimant.
   7. Au bout de 1 min, aspirez le TCM et mettez-le en suspension dans 1 mL de TCM frais pour laver les billes.
   8. Répétez cette procédure pour un total de trois lavages.
   9. Après le troisième lavage, remettre les billes en suspension dans 1 mL de TCM.
   10. Comptez les lymphocytes T.
   11. Transférez les billes dans les cellules T dans un rapport de 3:1 perles :cellules.
   12. Diluer les cellules à une concentration finale de 1 x 10⁶ cellules/mL.
   13. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 24 h.
2. Transfection et transduction des lymphocytes T
   1. Effectuer les travaux lentiviraux en utilisant les précautions BSL-2+, y compris les cagoules de culture cellulaire, l’équipement de protection individuelle et la désinfection des matériaux usagés avec de l’eau de Javel avant de les éliminer.
   2. Acquérir une construction de récepteur antigénique chimérique-T19 (CART19) dans un vecteur lentiviral.
      note: La construction CART19 utilisée ici a été conçue puis synthétisée de novo à l’aide d’un fournisseur de synthèse de protéines disponible dans le commerce. La construction CAR a ensuite été clonée dans un lentivirus de troisième génération sous le contrôle d’un promoteur EF-1α. Le fragment de région variable à chaîne unique est dérivé du clone FMC63 et reconnaît le CD19 humain. La construction CAR19 possède un domaine de costimulation 4-1BB de deuxième génération et une stimulation CD3ζ (FMC63-41BBz).
   3. Effectuer la production de lentiviraux comme décrit précédemment.
      1. En bref, pour produire un lentivirus, utilisez 293 cellules T qui ont atteint une confluence de 70 à 90 %.
      2. Laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante les réactifs de transfection, y compris 15 μg du plasmide lentiviral d’intérêt, 18 μg d’un vecteur d’emballage gag/pol/tat/rev, 7 μg d’un vecteur d’enveloppe VSV-G, 111 μL du réactif de pré-complexation, 129 μL du réactif de transfection et 9,0 mL du milieu de transfection avant de les ajouter aux cellules 293T. Cultivez ensuite les cellules transfectées à 37 °C, 5 % de CO₂.
      3. Récolte, centrifugation (900 x g pendant 10 min), filtre (filtre en nylon 0,45 μM) et concentré surnageant à 24 et 48 h par ultracentrifugation à 13 028 x g pendant 18 h ou 112 700 x g pendant 2 h.
      4. Congeler à -80 °C pour une utilisation future.
   4. Le jour 1, remettre doucement en suspension les cellules T pour briser les rosettes des cellules T qui avaient été stimulées à 1 x 10⁶/mL le jour 0.
   5. En prenant les précautions appropriées contre la BSL-2+ pour tous les tests lentiviraux, ajouter le virus récolté frais ou congelé aux lymphocytes T stimulés à une multiplicité d’infection (MOI) de 3,0.
3. Expansion des cellules CAR-T
   1. Pendant la phase d’expansion, continuez à incuber les lymphocytes T transduits à 37 °C, 5 % CO₂. Compter les cellules CAR-T les jours 3 et 5, et ajouter de la MTC fraîche et préchauffée à la culture pour maintenir une concentration de cellules CAR-T de 1 x 10⁶/mL.
   2. Retirez les billes des lymphocytes T transduits 6 jours après la stimulation (jour 6) à l’aide d’un aimant. Récoltez, mettez en suspension et placez les lymphocytes T dans des tubes coniques de 50 ml dans un aimant pendant 1 min. Récupérez ensuite le surnageant (qui contient les cellules CAR-T) et jetez les billes.
   3. Remettez en culture les cellules CAR-T collectées à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL pour reprendre l’expansion.
   4. Le jour 6, évaluer l’expression de surface du CAR par cytométrie en flux.
      note: Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour détecter l’expression superficielle de CAR, telles que la coloration avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris (H+L) de chèvre adsorbé ou par coloration avec un peptide spécifique de CD19, conjugué à un fluorochrome. Ici, prélevez une aliquote (environ 100 000 lymphocytes T) de la culture et lavez-la avec un tampon d'écoulement préparé avec de la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, 2 % de sérum de veau fœtal et 1 % d'azoture de sodium. Colorez les cellules avec l’anticorps anti-CAR et lavez-les deux fois. Colorez les cellules avec une coloration vivante/morte et un anticorps monoclonal CD3 (OKT3). Lavez les cellules et remettez-les en suspension dans le tampon d’écoulement. Acquisition sur un cytomètre pour déterminer l’efficacité de la transduction.
4. Cryoconservation par cellules CAR-T
   1. Pour récolter et cryoconserver les cellules CAR-T 8 jours après la stimulation (jour 8 de l’expansion des cellules T), récoltez les cellules de la culture.
   2. Faites tourner pendant 5 min à 300 x g.
   3. Remettre en suspension dans le milieu de congélation à raison de 10 millions de cellules par mL par flacon dans un milieu de congélation composé de 10 % de diméthylsulfoxyde et de 90 % de sérum de veau fœtal.
   4. Congeler dans un récipient de congélation pour atteindre un taux de refroidissement de -1 °C/min dans un congélateur à -80 °C, puis transférer à l’azote liquide après 48 h.
   5. Avant de les utiliser pour des expériences in vitro ou in vivo, décongeler les cellules CAR-T dans la MTC chaude.
   6. Lavez les cellules pour diluer et éliminer le diméthylsulfoxyde et remettez en suspension à une concentration de 2 x 10⁶ cellules/mL dans de la MTC chaude. Repos une nuit à 37 °C, 5 % CO₂.

2. Production de CART19 en facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF ^k/o)

1. Pour perturber le GM-CSF, utilisez un ARN guide (ARNg) ciblant l’exon 3 du GM-CSF humain (CSF2) sélectionné via le criblage des ARNg précédemment signalés comme ayant une efficacité élevée pour le gène CSF2 qui code pour la cytokine humaine GM-CSF.
   note: Une construction lentivirale de troisième génération Cas9 de troisième génération synthétisée commercialement et contenant cet ARNg (sous un promoteur U6) a été utilisée. La construction contient un gène de résistance à la puromycine. La séquence de l’ARNg est GACCTGCCTACAGACCCGCC.
2. Pour produire un lentivirus, utilisez des cellules 293T qui ont atteint une confluence de 70 à 90 %.
3. Laisser incuber 15 μg du plasmide lentiviral d’intérêt, 18 μg d’un vecteur d’emballage gag/pol/tat/rev, 7 μg d’un vecteur d’enveloppe VSV-G, 111 μL du réactif de pré-complexation, 129 μL du réactif de transfection et 9,0 mL du milieu de transfection pendant 30 min à température ambiante.
4. Ajoutez des réactifs de transfection aux cellules 293T. La culture à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO₂).
5. Récolte, centrifugation (900 x g pendant 10 min), filtre (filtre en nylon de 0,45 μM) et concentration du surnageant à 24 et 48 h par ultracentrifugation à 13 028 x g pendant 18 h ou 112 700 x g pendant 2 h et congélation à -80 °C pour une utilisation future.
6. Le jour 1, remettez doucement les cellules T en suspension pour briser les rosettes.
7. Dans un laboratoire approuvé BSL-2+, ajoutez un virus congelé ou fraîchement récolté aux cellules T stimulées pour générer des cellules CAR-T. Transduisez les lymphocytes T avec le lentivirus CAR19 et le lentivirus GM-CSF ciblant le lentivirus CRISPR. Ajouter le lentivirus CAR19 à un moment d’inertie de 3. Étant donné qu’il n’était pas possible de titrer le lentivirus CRISPR, utilisez des particules virales générées à partir d’une préparation plasmidique de 15 μg pour transduire 10 x 10^{cellules 6} T.
8. Voir les étapes restantes de la stimulation, de l’expansion et de la cryoconservation des lymphocytes T, comme indiqué à l’étape 1.
9. Pour les lymphocytes T modifiés par lentiCRISPR présentant une résistance à la puromycine, traiter les cellules avec du dichlorhydrate de puromycine à une concentration de 1 μg de puromycine par 1 mL le jour 3 et le jour 5.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	Référence 12-0037-42
Anticorps monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	Référence 17-0038-42
Choix Taq Blue Mastermix	Denville Scientific	C775Y51
CTS (Systèmes de Thérapie Cellulaire) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	Réf. 40203D
Système CytoFLEX B4-R2-V2	Beckman Coulter	Réf. C10343	Cytomètre en flux
Diméthylsulfoxyde	Millipore Sigma	D2650-100ML
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	Gibco	Référence 14190 à 144
Dynabeads MPC-S (concentrateur de particules magnétiques)	Biosystèmes appliqués	A13346
Aimant Easy 50 EasySep	Technologies STEMCELL	Référence 18002
Kit d’isolement de lymphocytes T humains EasySep	Technologies STEMCELL	17951	Perles magnétiques à sélection négative ; 17951RF comprend des pointes et un tampon
Sérum fœtal bovin	Millipore Sigma	F8067
FITC souris anti-humaine CD107a	BD Pharmingen	Référence 555800
Milieu de fixation (Medium A)	Invitrogen	GAS001S100
Construction de l’ARNg GenCRISPR : Nom : CSF2	GenScript	N/A	Commande personnalisée
ARN guide CRISPR 1 ; Espèce : Humain, Vecteur :
pLentiCRISPR v2 ; Résistance : Ampicilline ; Numéro d’exemplaire :
haut; Préparation du plasmide : Débit standard : 4 μg (Gratuit
de charge)
Anticorps secondaire anti-IgG de souris (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Génétique de bureau
Sérum AB humain ; Donneurs masculins ; type AB ; Nous	Corning	Référence 35-060-CI
Anticorps monoclonal IFN gamma (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	Tél. : 47 7319-42
Lipofectamine 3000 Réactif de transfection	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Kit de coloration Aqua Dead Cell fixable, pour une excitation de 405 nm	Invitrogen	N° L34966
Lymphoprep	Technologies STEMCELL	Référence 7851
Solution Monensin, 1000X	BioLégende	420701
Souris Anti-Humain CD28 Clone CD28.2	BD Pharmingen	Référence 559770
Souris Anti-Humain CD49d Clone 9F10	BD Pharmingen	561892
Souris Anti-Humain MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Conteneur de congélation Mr. Frosty	Thermo Scientific	Référence 5100-0001
NALM6, clone G5	ATCC	CRL-3273	Lignée cellulaire de leucémie lymphoblastique aiguë
Eau sans nucléases	Promega	P119C
Systèmes de filtration sous vide Olympus, 500 ml, membrane PES, 0,22 uM, stérile	Genesee Scientific	25 à 227
Systèmes de filtration sous vide Olympus, 500 ml, membrane PES, 0,45 uM, stérile	Genesee Scientific	25 à 228
Opti-MEM I Sérum Réduit Moyen (1X), Liquide	Gibco	Référence 31985-070
PE-CF594 Souris anti-IL-2 humaine	BD Horizon	562384
Pénicilline-streptomycine-glutamine (100X), liquide	Gibco	Référence 10378-016
Milieu de perméabilisation (Medium B)	Invitrogen	GAS002S100
Mini kit d’ADN génomique PureLink	Invitrogen	K182001
Chlorhydrate de puromycine	MP Biomedicals, Inc.	210055210
Kit d’extraction de gel QIAquick	QIAGEN	Référence 28704
Rat Anti-Humain GM-CSF BV421	BD Horizon	Référence 562930
RoboSep-S	Technologies STEMCELL	21000	Séparateur de cellules entièrement automatisé
SepMate-50 (IVD)	Technologies STEMCELL	Référence 85450
Azoture de sodium, 5 % (p/v)	Ricca Chemical	Référence 7144.8-16
X-VIVO 15 Milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum	Lonza	04-418Q