Une technique CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes dans les lymphocytes T

Dans cet article

Résumé

Source : Agarwal, S., et al. Production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente un test permettant d’effectuer l’édition de gènes dans des cellules T humaines à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un mélange de lymphocytes T CD4+ et CD8+ primaires est associé à un complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9, ciblant des gènes spécifiques pour l’inactivation. Lors de l’électroporation, l’ARNsg guide Cas9 vers la séquence d’ADN cible, créant ainsi des coupes précises. Ces coupures sont ensuite réparées par le mécanisme d'assemblage non homologue de la cellule, ce qui entraîne l'inactivation des gènes.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Conception d’ARNsg et de perturbation génique dans les lymphocytes T humains primaires

Conception du sgRNAs
CRISPR note: Plusieurs serveurs et programmes facilitent la conception d’ARN guide unique spécifiques à la cible (ARNsg). Dans ce protocole, des ARNg à répétitions palindromiques courtes (CRISPR) groupées et régulièrement espacées ont été conçus à l’aide de CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) et du portail de conception d’ARNg du Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
1. Pour chaque gène cible, concevez six à dix séquences d’ARNsg pour cibler les séquences d’exons codantes précoces.
  REMARQUE : l’ARNsg doit avoir une efficacité élevée sur la cible et une faible efficacité hors cible. Chaque algorithme d’apprentissage automatique permettant de déterminer l’efficacité de l’ARNsg fonctionne légèrement différemment. Par conséquent, il est recommandé de comparer plusieurs outils de conception d’ARNsg et de dresser une liste de six à dix ARNsg pour le dépistage.
Perturbation génique dans les lymphocytes T humains primaires
1. Obtenez des cellules mononucléées de sang périphérique autologue (PBMC) à partir de donneurs volontaires sains. Une chronologie schématique du protocole est décrite à la figure 1A et décrite ci-dessous.
2. Isolez les lymphocytes T CD4+ et CD8+ à l’aide de trousses de sélection de CD4 et CD8 disponibles dans le commerce.
3. Combinez les lymphocytes T CD4+ et CD8+ dans un rapport de 1:1 et incubez pendant la nuit à^{raison de 3} x 10 6 cellules/ml de R10 complétés par 5 ng/mL d’interleukine-7 humaine (huIL-7) et d’interleukine humaine -15 (huIL-15) chacune. L’ajout d’IL-7 et d’IL-15 est recommandé car ils sont connus pour favoriser un phénotype de mémoire centrale et les cellules CAR-T du récepteur antigénique chimérique (CAR)-T élargies avec l’IL-7 et l’IL-15 ont une efficacité antitumorale supérieure par rapport aux cellules CAR-T expansées d’interleukine-2 (IL-2).
4. Le lendemain, comptez les lymphocytes T et centrifugez 5-10 x 10⁶ cellules à 300 x g pendant 5 min. Jetez tout le surnageant et lavez la pastille cellulaire dans un milieu essentiel minimal à sérum réduit. Remettre la pastille en suspension dans 100 μL de solution de nucléofection conformément aux instructions du fabricant (tableau des matériaux).
5. Pendant le lavage des cellules, préparez le complexe ribonucléoprotéique (RNP) avec la protéine 9 associée à CRISPR (Cas9) et l’ARNg en incubant 10 μg de nucléase Cas9 avec 5 μg d’ARNsg pendant 10 min à température ambiante (RT). Le rapport molaire de Cas9/ARNsg est de 1:2,4. Il est recommandé d’utiliser un contrôle fictif contenant Cas9 et un amplificateur d’électroporation, mais pas d’ARNsg.
  note: L’édition génomique multiplex peut être effectuée à cette étape en créant des complexes RNP pour chaque cible séparément et en les combinant avec des cellules au moment de la nucléofection, comme décrit à l’étape suivante. Le choix des réactifs pour assembler le complexe RNP est essentiel pour obtenir une efficacité de knockout (KO) élevée. Par exemple, les nucléases Cas9 de différents fournisseurs ont des effets hors cible variables, et l’ARNg chimiquement modifié diminue la toxicité pour les lymphocytes T, augmentant ainsi l’efficacité du KO.
6. Combinez les cellules remises en suspension de l’étape 1.2.4 avec le complexe RNP de l’étape 1.2.5 et ajoutez 4,2 μL d’amplificateur d’électroporation 4 μM (oligonucléotide d’ADN simple brin [ADNsb] qui n’est pas homologue au génome humain). Bien mélanger et transférer dans des cuvettes d’électroporation. Évitez les bulles car elles nuisent à l’efficacité de l’électroporation.
7. Électroporat des cellules à l’aide du code d’impulsion EH111. Après électroporation, incuber des cellules dans R10 complétées par 5 ng/mL de huIL-7 et huIL-15 à 5x10^{6 cellules}/mL à 30 °C pendant 48 h dans des plaques à 12 puits. Après 48 h, procédez à l’activation et à l’expansion des lymphocytes T.

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Résultats

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Graphique 1. Expansion des cellules CAR-T modifiées et doublement de leur population. (A) Chronologie de l’édition et de la fabrication de CRISPR dans les cellules CART humaines primaires. (B) Doublements de population dans les cellules CAR-T CD19 simulées et modifiées par CRISPR, mesurés à l’aide d’un compteur de Coulter pendant l’expansion d...