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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Logement et entretien des souris
- Achetez des souris NSG âgées de 6 à 8 semaines (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Hébergez les souris dans des conditions SPF avec un échange d’air, des préfiltres et des filtres à particules à haute efficacité (HEPA) (0,22 μm) dans une pièce où la température, l’humidité et la pression sont contrôlées.
- Hébergez et entretenez les souris dans des cages individuelles de micro-isolement autoclavées dans un système de rack capable de gérer l’échange d’air avec des préfiltres et des filtres HEPA (0,22 μm).
- Effectuer toutes les procédures et manipulations des souris dans une hotte de sécurité biologique de classe II de type A2 qui a été prétraitée avec de l’éthanol à 70 %. Avant de travailler dans la salle des animaux, prenez une douche et enfilez des blouses propres, une combinaison Tyvek, des couvre-bottes, un bonnet de cheveux, un masque facial et des gants. Portez une blouse chirurgicale par-dessus la combinaison Tyvek pendant les interventions chirurgicales.
note: La décontamination aux rayons ultraviolets (UV) est également préférable avant les procédures.
- Autoclavez tous les instruments et réactifs si possible, puis désinfectez-les avant de les transférer dans la hotte.
- Pendant les procédures, retirez les cages ventilées individuellement des animaux du support et désinfectez-les avant de les transférer dans la hotte.
- Nourrissez les souris avec un régime irradié et fournissez de l’eau autoclave. Fournir des aliments irradiés et compléter avec des aliments irradiés supplémentaires au besoin. Changez l’eau autoclavée chaque semaine ou au besoin.
note: L’eau acidifiée autoclavée peut également être utilisée. Le régime irradié fourni avait une durée de conservation de 6 mois après sa fabrication.
2. Génération de souris humanisées de moelle osseuse, de foie et de thymus (BLT)
REMARQUE : La génération de souris hu-BLT a été décrite précédemment.
- Le jour de l’opération, irradiez le corps entier des souris à une dose de 12 cGy/g de poids corporel.
- Préparez les souris pour la chirurgie.
- Donnez à chaque souris irradiée un mélange de kétamine à la concentration de travail de 100 mg/kg et de xylazine à la concentration de 12 mg/kg, qui variait de 130 à 170 μL par souris en fonction du poids corporel par injection intrapéritonéale (IP) pour l’anesthésie. Pour préparer 3 ml du mélange de kétamine et de xylazine, ajoutez 0,27 mL de kétamine à la concentration de base de 100 mg/mL et 0,03 mL de xylazine à la concentration de 100 mg/mL à 2,7 mL de solution saline stérile et mélangez bien. Désinfectez la peau avec de l’isopropanol à 70 % avant l’injection.
- Administrer à chaque souris irradiée 1 mg/kg de poids corporel (demi-vie 72 h, SR-LAB) par injection sous-cutanée pour une gestion durable de la douleur.
- Administrer à chaque souris irradiée 100 μL (858 μg) de céfazoline par injection IP pour une antibioprophylaxie préopératoire
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- Rasez les poils des souris à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique autour du côté latéral gauche et médial de la souris au dernier site chirurgical utilisé pour exposer le rein gauche.
- Vérifiez le bon niveau d’anesthésie par réflexe de pédale (pincement ferme des orteils).
- Donnez de l’isoflurane à 3-5 % si une anesthésie supplémentaire est nécessaire à tout moment pendant la chirurgie.
- Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation de la cornée. Appliquez une étiquette d’oreille si nécessaire.
- Effectuez une intervention chirurgicale pour implanter les tissus du foie et du thymus dans la capsule rénale gauche.
- Désinfectez la peau au niveau du site chirurgical en appliquant un gommage à l’iode en partant du centre du site chirurgical et en allant vers l’extérieur de manière circulaire. Répétez ce processus avec 70 % d’isopropanol et une troisième fois avec de l’iode.
- À l’aide d’une pince, chargez d’abord un fragment de tissu hépatique fœtal humain dans un trocart. Ensuite, à l’aide d’une pince, chargez un fragment de tissu de thymus fœtal humain dans le trocart. Ensuite, à l’aide d’une pince, chargez un autre fragment de tissu hépatique fœtal humain dans le trocart. Les mouchoirs doivent être coupés à 1-1,6 mm3 pour s’adapter aux dimensions intérieures du trocart.
- Utilisez des pinces pour soulever la peau et utilisez des ciseaux pour faire une petite coupe longitudinale. Étendez la coupe à 1,5-2 cm sur le côté gauche de la souris.
- Utilisez des pinces pour soulever la couche musculaire et utilisez des ciseaux pour faire une petite coupe longitudinale. Étendez la coupe au besoin pour exposer le rein.
- Exposez le rein en saisissant doucement le tissu adipeux qui entoure le rein. Ne touchez pas directement le parenchyme rénal.
- Faites une incision de 1 à 2 mm à l’extrémité postérieure de la capsule rénale à l’aide d’un scalpel.
- Insérez lentement le trocart préchargé à travers l’incision parallèle à l’axe long du rein et relâchez les tissus entre la capsule rénale et le rein.
- Remettez délicatement le rein et l’intestin dans leur position normale. Utilisez des sutures résorbables 5/0 P-3 (P-13) avec une aiguille circulaire 3/8 de 13 mm pour fermer la couche musculaire et des agrafes chirurgicales pour fermer la peau.
- Après l’opération, placez la souris dans une cage de micro-isolement autoclavée propre pour la récupération.
- Pour minimiser les pertes de chaleur pendant la récupération post-chirurgicale, placez la cage contenant les souris sur un coussin chauffant relié à une pompe à eau qui réchauffe et fait circuler l’eau.
- Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles aient repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
- Dans les 6 heures suivant la fin de l’opération, injectez par la veine caudale des cellules souches hématopoïétiques CD34+ isolées du tissu hépatique fœtal humain.
- Réchauffez les souris avec une lampe chauffante. Désinfectez la queue avec de l’isopropanol à 70 %, puis injectez 1,5 à 5 × 105 cellules souches/200 μL dans la veine de la queue.
- Arrêtez tout saignement de l’injection et renvoyez les souris dans la cage du micro-isolateur et la cage du micro-isolateur dans le support de la cage.
note: Les souris post-opératoires sont généralement logées ensemble, cinq par cage de micro-isolement, pendant et après la convalescence. Cependant, les souris ne sont logées ensemble que si elles ont toutes été opérées le même jour.
- Vérifiez les souris tous les jours. Surveillez attentivement les agrafes chirurgicales et remplacez-les au besoin. Surveillez de près les souris pour détecter tout signe d’infection ou d’inconfort. Fournir de la nourriture autoclavée sur le sol de la cage du micro-isolant pendant quelques jours après l’opération.
- Retirez les agrafes chirurgicales 7 à 10 jours après l’opération. Donnez de l’isoflurane à 3-5 % pour anesthésier les souris. Retirez soigneusement les agrafes, puis appliquez un antibiotique et une pommade analgésique sur le site.
- Attendez 9 à 12 semaines pour la reconstitution des cellules immunitaires humaines, puis prélevez du sang périphérique de la veine saphène médiale de chacune des souris humanisées.
- Retenez les souris conscientes à l’aide d’un cône en plastique de taille appropriée avec une ouverture près de la tête de la souris pour respirer et une ouverture près de l’arrière de la souris pour isoler une patte. Mettez les souris dans le cône de contention la tête en premier, puis tirez doucement une patte à travers l’ouverture de la jambe.
- Vaporisez la face médiale de la jambe isolée avec 70 % d’isopropanol, puis étalez un antibiotique et une pommade analgésique sur le même site.
note: La pommade aide à révéler l’emplacement de la veine sans qu’il soit nécessaire de l’épiler et aide également à la formation de gouttelettes de sang.
- À l’aide d’une aiguille de calibre 25 à un angle de 90°, percez la veine et prélevez 50 à 100 μL de sang à l’aide d’un tube de prélèvement sanguin enrobé d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Arrêtez le saignement en appliquant une pression sur le site avec de la gaze stérile. Une fois que le saignement s’est arrêté, remettez les souris dans leur cage.
note: Les volumes sanguins maximaux prélevés sont généralement de 50 μL par semaine ou de 100 μL toutes les deux semaines.
- Utilisez le sang périphérique prélevé pour tester le niveau de reconstitution des cellules immunitaires humaines à l’aide de la cytométrie en flux avec des anticorps pour hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. Traitement antibiotique
- Avant le traitement antibiotique, prélever des échantillons de matières fécales avant le traitement. Déplacez les souris dans une nouvelle cage de micro-isolement autoclave.
- Préparez quotidiennement un cocktail frais d’antibiotiques à large spectre.
- Préparez 250 ml d’eau contenant du métronidazole (1 g/L), de la néomycine (1 g/L), de la vancomycine (0,5 g/L) et de l’ampicilline (1 g/L) fraîchement préparés pour chaque cage de micro-isolement de souris.
note: Utilisez de l’eau autoclavée ou stérile pour l’eau potable supplémentée en antibiotiques.
- Ajouter 9,2 g de mélange pour boisson sucrée au sucre de raisin à 250 ml d’eau supplémentée en antibiotiques.
note: L’utilisation d’un mélange de boisson sucrée au sucre de raisin masque le goût amer des antibiotiques et aide à prévenir la déshydratation chez les souris.
- Changez l’antibiotique et le sucre de raisin, mélangez la boisson sucrée, complétez l’eau et placez les souris dans une nouvelle cage autoclavée tous les jours.
note: Les souris sont coprophages et changer les cages quotidiennement empêche les souris de se réinoculer avec des bactéries intestinales.
- Pour une greffe maximale du microbiome intestinal de type humain, fournissez des antibiotiques pendant 14 jours. Pendant le traitement antibiotique, surveillez les souris pour la perte de poids et la déshydratation. La perte de poids est attendue pendant les 3-4 premiers jours et plafonne ensuite pendant toute la durée du traitement. En cas de déshydratation, donnez aux souris une solution saline ou Ringers par injection intrapéritonéale.
note: D’autres protocoles d’humanisation du microbiome intestinal nécessitent un gavage oral d’antibiotiques. Bien qu’efficace pour épuiser les bactéries intestinales murines, nous avons constaté que la méthode moins invasive d’ajout d’antibiotiques à l’eau potable exerçait moins de stress sur nos souris humanisées et conduisait à de meilleurs résultats.
4. Échantillons de donneurs et transplantation fécale
- Préparez des échantillons de matières fécales de donneurs humains.
- Utilisez des sources de matériel de transplantation de microbiote fécal (FMT) correctement préparées pour la transplantation fécale chez les souris humanisées.
- Décongeler les préparations de FMT et les aliquoter dans des conditions anaérobies dans une chambre anaérobie.
- Si vous le souhaitez, à cette étape, mélangez des parties égales des échantillons fécaux pour créer un échantillon « humain » non biaisé.
- Limitez au minimum la congélation et la décongélation du matériau FMT, si l’aliquotage ou le mélange des échantillons n’est pas nécessaire, décongelez-le uniquement immédiatement avant la procédure.
- Transplantation fécale humaine
- Après 14 jours de traitement antibiotique, remplacez l’eau de boisson par de l’eau autoclavée et placez les souris dans une nouvelle cage autoclave. Arrêtez les changements quotidiens de cage et mettez en place un calendrier de changement de cage une à toutes les 1 à 2 semaines.
- Administrer deux greffes fécales 24 et 48 heures après l’arrêt des antibiotiques.
- 24 h après le traitement antibiotique, décongeler la quantité nécessaire de matière FMT et donner à chaque souris 200 μL de matière FMT par gavage oral. Répétez la procédure 48 heures après les antibiotiques.
- Étalez tout matériau FMT décongelé restant ou restant sur la fourrure des souris humanisées ou sur la litière de la cage.