Génération d’un vaccin multivalent à vésicules de la membrane externe

Abstract

Source : Feng, R., et al. Une plateforme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules membranaires externes présentant le domaine de liaison au récepteur du SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo présente une méthode permettant de générer des vaccins multivalents à vésicules de membrane externe (OMV). Des cellules de mammifères sont transfectées pour exprimer et sécréter des antigènes viraux fusionnés à un SpyTag et à un marqueur de polyhistidine. Ces antigènes sont ensuite purifiés à l’aide d’une colonne d’affinité d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA). L’antigène purifié est mélangé à des vésicules de membrane externe exprimant la protéine SpyCatcher (SC) liée à la surface. Plusieurs antigènes se fixent de manière covalente aux SpyCatchers via leurs SpyTags (ST), créant ainsi des OMV qui affichent l’antigène, servant de vaccin multivalent.

Protocol

1. Construction du plasmide

1. Insérer de l’ADN codant pour la séquence SpyCatcher (Figure 1) dans un plasmide pThioHisA-Cytolysin A (ClyA) résistant à l’ampicilline (voir le tableau des matériaux) entre les sites BamH I et Sal I pour construire le plasmide pThioHisA ClyA-SC à la suite d’un rapport précédemment publié.
2. Comparez le gène de fusion synthétisé du domaine de liaison au récepteur (RBD)-polyhistidine (Histag) (Figure 1) synthétisé dans un plasmide pcDNA3.1 (voir le tableau des matériaux) entre les sites BamH I et EcoR I pour construire le plasmide pcDNA3.1 RBD-ST à la suite d’un rapport précédemment publié.

2. Préparation OMV-SC

1. Effectuez la transformation ClyA-SC en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Ajouter 5 μL de solution plasmidique pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) à 50 μL de souche compétente BL21, souffler doucement et laisser refroidir sur de la glace pendant 30 min.
   2. Placez la solution pendant 90 s dans le bain-marie à 42 °C, puis mettez immédiatement la solution mélangée sur de la glace pendant 3 min.
   3. Ajouter 500 μL de milieu Luria-Bertani (LB) à la suspension bactérienne et, après mélange, cultiver à 220 tr/min à 37 °C pendant 1 h.
   4. Déposer toute la transformation sur une plaque de gélose LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL, voir le tableau des matières) et faire culture pendant une nuit à 37 °C
      note: Dans des expériences ultérieures, l’ampicilline a été maintenue à la même concentration dans le milieu. Sinon, cela peut entraîner une perte de plasmides dans les bactéries.
2. Pour la production OMV-SC, effectuez les étapes ci-dessous.
   1. Isoler une seule colonie de la plaque (étape 2.1.4.) jusqu’à 20 mL de milieu LB (résistant à l’ampicilline) et la faire cultiver pendant une nuit à 220 tr/min à 37 °C.
   2. Inoculer la solution bactérienne (à partir de l’étape 2.2.1.) dans un milieu de 2 L, cultiver à 220 tr/min, 37 °C pendant 5 h jusqu’au stade de croissance logarithmique (la DO₆₀₀nm est comprise entre 0,6 et 0,8).
   3. Lorsque la DO à 600 nm de la solution bactérienne atteint 0,6-0,8, ajoutez de l’isopropyl bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, voir le tableau des matériaux) pour obtenir la concentration finale de la solution bactérienne à 0,5 mM, puis cultivez pendant la nuit à 220 tr/min à 25 °C.
3. Effectuez la purification OMV-SC.
   1. Centrifuger la solution bactérienne à 7 000 x g à 4 °C pendant 30 min.
   2. Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre à membrane de 0,22 μm, puis concentrez-le à l’aide d’une membrane d’ultrafiltration de 100 kD ou d’une colonne à fibres creuses (voir tableau des matériaux).
   3. Filtrer le concentré à travers un filtre à membrane de 0,22 μm, puis le centrifuger à 150 000 x g à 4 °C pendant 2 h à l’aide d’une ultracentrifugeuse (voir le tableau des matériaux), et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
   4. Remettre les précipitations en suspension avec du PBS et les stocker à −80 °C. La solution peut maintenir une stabilité à long terme à −80 °C.

3. Préparation RBD-ST

1. Effectuez la transfection RBD-ST en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Choisissez un système d’expression eucaryote approprié (par exemple, HEK293F) et cultivez les cellules pendant la nuit à 130 tr/min à 37 °C après la récupération.
   2. Ajouter 20 μL de solution cellulaire HEK293F dans le compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux), noter le nombre de cellules, ajuster la concentration à 1 x 106 cellules/mL, puis cultiver les cellules à 130 tr/min à 37 °C pendant 4 h.
   3. Filtrer le plasmide RBD-ST à travers un filtre à membrane de 0,22 μm et ajouter 300 μg de plasmides dans le milieu de culture cellulaire (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce que le volume final soit de 10 mL ; agiter pendant 10 s.
   4. Chauffer la polyéthylénimine (PEI, 1 mg/mL, voir le tableau des matières) à 65 °C dans le bain-marie, mélanger 0,7 mL de PEI avec 9,3 mL de milieu de culture cellulaire et agiter par intermittence pendant 10 s.
      note: Ne secouez pas vigoureusement la solution. Sinon, les bulles résultantes peuvent affecter l’efficacité de la transfection.
   5. Ajouter la solution plasmidique à la solution de PEI, agiter le mélange par intermittence pendant 10 s et l’incuber à 37 °C pendant 15 min.
   6. Ajouter le mélange à 280 mL de milieu de culture cellulaire et cultiver à 130 tr/min à 37 °C pendant 5 jours.
2. Effectuer la purification RBD-ST.
   1. Centrifugez les cellules à 6 000 x g à 25 °C pendant 20 min et utilisez une pipette pour recueillir le surnageant.
   2. Remplissez la colonne avec 2 mL d’agarose Ni-NTA (voir le tableau des matériaux) et lavez-la 3 fois avec 3 fois de PBS.
   3. Ajouter de l’imidazole (voir le tableau des matériaux) dans le surnageant cellulaire pour obtenir la concentration finale de 20 mM, et charger le surnageant cellulaire 2x.
   4. Ajouter 3 volumes de colonne (CV) de PBS contenant 20 mM d’imidazole pour le lavage, et recueillir la fraction de lavage.
   5. Eluté de gradient avec 3 CV de PBS contenant des concentrations faibles à élevées (p. ex., 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) d’imidazole ; élué 2x pour chaque concentration.
   6. Utilisez SDS-PAGE pour identifier le RBD-ST dans différents gradients de concentration.

4. Bioconjugaison et purification OMV-RBD

1. Déterminez la concentration en protéines par la méthode du dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) (voir le tableau des matériaux).
   1. Diluer en série la solution standard de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) de 2 mg/mL à 0,0625 mg/mL, diluer l’OMV-SC purifié et le RBD-ST 10x, puis mélanger les solutions de travail BCA A et B (fournies dans la trousse de dosage) dans un rapport de 50:1 (v/v).
   2. Ajouter une solution protéique diluée (25 μL/puits) et mélanger avec une solution de travail de BCA (200 μL/puits) ; incuber à 37 °C pendant 30 min.
   3. Mesurez l’absorbance (DO) à 562 nm de chaque puits et calculez la concentration en protéines à partir de la courbe standard.
2. Effectuez la bioconjugaison de l’OMV-SC et du RBD-ST en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Mélanger OMV-SC et RBD-ST dans PBS à un rapport de 40:1 (p/p).
   2. Tournez verticalement pour mélanger le mélange pendant la nuit à 15 tr/min à 4 °C.
      note: Différents antigènes peuvent réagir dans des proportions différentes. On pourrait essayer différents rapports de réaction en fonction des caractéristiques de l’antigène.

Results

Figure 1 : Séquences plasmidiques utilisées dans la présente étude.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicilline sodique	Sangon Biotech	A610028
Compteur de cellules automatisé	Countstar	biotechnologie
Kit de quantification des protéines BCA	cwbio	CW0014S
Appareil d’électrophorèse	Cavoy	Puissance BV
Centrifugeuse de congélation à grande vitesse	Bioridge	H2500R
Souris His-Tag mAb	Technologie de signalisation cellulaire	Roues 2366
Imidazole	Sangon Biotech	A600277
Isopropyl bêta-D-thiogalactopyranoside	Sangon Biotech	A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow	Qiagen	Référence 70691
Milieu de culture cellulaire OPM-293	Opm biosciences	Référence 81075-001
pcDNA3.1 Plasmide RBD-ST	Génologie biologique de Wuhan
Tampon phosphate salin	ZSGB-bio	ZLI-9061
Polyéthylénimine linéaire	Polysciences	Référence 23966-1
Échelle protéique précolorée	thermo	Référence 26616
Plasmide pThioHisA ClyA-SC	Génologie biologique de Wuhan
Systèmes de paillasse Quixstand (colonne à fibres creuses de 100 kD)	GE Soins de santé
Tampon de chargement SDS-PAGE (5x)	Beyotime	Réf. P0015
chlorure de sodium	Sangon Biotech	A100241
Instrument de suspension	Technologie de la vie	Mélangeur Hula
Tryptone	Oxoïde	LP0042B
Ultracentrifuge	Soc Beckman	XPN-100
Spectrophotomètre ultraviolet	Hitachi	U-3900
Extrait de levure	Sangon Biotech	A610961