Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Formulation et sélection du dispositif pour la génération d’aérosols pharmaceutiques
REMARQUE : La formulation et le choix du dispositif dépendent des propriétés physicochimiques de chaque médicament à aérosoliser.
- Aérosols liquides nébulisés.
- Dissoudre le médicament dans 100 mL d’eau ou de solution saline physiologique.
- Chargez une seringue de 100 ml avec la solution médicamenteuse et placez la seringue dans le pousse-seringue avec un débit réglé à 1 mL/min.
- Connectez le pousse-seringue au nébuliseur à jet et purgez l’air de la conduite d’alimentation menant au nébuliseur.
- Connectez la source d’air sous pression au nébuliseur à jet et réglez le débitmètre d’air sur 10 L/min.
- Insérez le nébuliseur à jet dans le pré-séparateur. Le pré-séparateur relie le nébuliseur au plénum central des aérosols de l’unité d’inhalation (figure 1).
REMARQUE : De nombreux composés médicamenteux ont une solubilité aqueuse limitée et sont mieux formulés sous forme d’aérosols de poudre sèche. Si une suspension stable peut être fabriquée à partir d’un composé de diamètre aérodynamique médian de masse micronisée (MMAD < 5 μM), elle peut être utilisée avec le nébuliseur à jet. Des précautions doivent être prises car la suspension peut obstruer le nébuliseur. Des concentrations d’alimentation par nébuliseur allant de 1 mg/mL pour les composés puissants (comme le bronchodilatateur ipratropium) à 40 mg/mL pour les suspensions (pour les composés moins puissants comme le sulfate de salbutamol) ont été utilisées. Le débit d’alimentation de la pompe à seringue est réglé à 1 mL/min pour une raison pratique : permettre de terminer la période d’équilibre de la concentration d’aérosol et l’exposition de 45 minutes sans qu’il soit nécessaire de recharger la seringue.
2. Configuration de l’expérience d’exposition aux aérosols
- Mesurer la concentration du médicament (en recueillant l’aérosol sur un filtre absolu) et la distribution granulométrique (en recueillant l’aérosol à l’aide d’un impacteur en cascade) de l’aérosol qui pénètre dans l’unité d’inhalation après le pré-séparateur/cyclone. Utilisez ces paramètres, la ventilation minute de l'animal, le poids corporel et le temps d'exposition, pour estimer la dose de médicament déposée dans les poumons.
- Pesez le filtre absolu et notez le poids du filtre. Placez le filtre dans le porte-filtre et assemblez le porte-filtre. Raccorder l’entrée du porte-filtre absolu à un orifice central d’échantillonnage du plénum d’aérosol et la sortie à une source de vide réglée pour échantillonner l’aérosol à un débit de 1 L/min pour l’expérience.
REMARQUE : La masse du médicament sur le filtre après l’échantillonnage pendant 45 minutes peut être inférieure au microgramme et/ou être mélangée avec du lactose, du sel NaCl ou un autre véhicule. Une microbalance qui lit jusqu’à 0,1 microgramme est nécessaire. Le filtre doit être équilibré et pesé dans un environnement à humidité contrôlée pour obtenir un poids précis du médicament déposé sur le filtre. Le poids du médicament sur les filtres ne peut être utilisé dans le calcul de la dose que s’il n’y a pas de véhicule dans la formulation ou si le véhicule est constitué d’eau. Lorsqu’il y a un véhicule dans la formulation autre que l’eau, le poids de la substance sur le filtre ne donne qu’un point de départ estimé pour une analyse plus approfondie du contenu du médicament par chromatographie liquide à haute performance (HPLC).
- Pesez et notez le poids des 7 filtres d’étage d’impacteur en cascade et d’un dernier filtre « cordier ». Placez un filtre sur chacun des sept étages de l’impacteur en cascade et assemblez l’impacteur en cascade Mercer. Raccorder l’entrée de l’impacteur en cascade à un orifice central d’échantillonnage du plénum d’aérosol et la sortie à une source de vide réglée pour échantillonner l’aérosol au débit auquel l’impacteur en cascade est étalonné (généralement 0,5 ou 1 L/min) pendant la durée de l’expérience.
- Surveillez la teneur en aérosols de l’unité d’inhalation à l’aide du moniteur d’aérosols en temps réel (voir le Tableau des matériaux et des réactifs) pour confirmer que les générateurs d’aérosols fonctionnent et produisent un aérosol stable tout au long de l’expérience. Connectez l’entrée du détecteur d’aérosols en temps réel à un orifice central d’échantillonnage du plénum d’aérosol et la sortie à une source de vide réglée pour échantillonner l’aérosol à un débit de 1 L/min pour l’expérience.
REMARQUE : Le signal en temps réel du moniteur d’aérosols est indiqué en μg/L, mais il est calibré pour la poussière de la route et doit être recalibré pour chaque aérosol de médicament afin d’obtenir des valeurs de concentration d’aérosol correctes. L'étalonnage n'est pas nécessaire lors de l'utilisation du moniteur pour confirmer la présence ou l'absence de concentration d'aérosols et la stabilité temporelle.
- Réglez les paramètres de contrôle du processus (débit d’air, vide, pression, puissance du générateur d’aérosols) aux valeurs requises qui dépendent du nombre d’animaux connectés à l’unité d’inhalation. L’unité d’inhalation et les générateurs d’aérosols sont contrôlés/surveillés en permanence par un système informatisé de contrôle de processus et d’acquisition de données (CODO) fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux et des réactifs). Le débit d’air dans l’unité d’inhalation doit être d’au moins 2 fois supérieur au débit de ventilation minute total de tous les animaux de l’unité d’inhalation afin d’éviter une accumulation de CO2.
- Chargez les souris dans des dispositifs de contention nasaux uniquement avant de les exposer à des aérosols dans l’unité d’inhalation nasale uniquement. Chargez également les animaux de contrôle du stress dans des dispositifs de contention pour qu’ils respirent l’air ambiant.
REMARQUE : Une expérience dose/réponse consiste en plusieurs groupes de souris exposées à des aérosols pendant des durées variables. Le temps d'exposition contrôle la dose de chaque groupe au cours d'une expérience dose/réponse.
- Inclinez le tube de retenue vers le plafond tout en essayant de charger les animaux, car ils ont tendance à courir vers le haut, essayant de s’échapper. Pointer les tubes vers le bas pendant le chargement encouragera à faire demi-tour et à s’échapper par l’arrière du tube. Assurez-vous que le nez de la souris est orienté vers l'extrémité pointue du tube et fixez le piston à position variable dans l'extrémité arrière du dispositif de contention.
REMARQUE : Le piston est conçu pour permettre à la queue de la souris de dépasser du support, ce qui permet à la souris de réguler sa température corporelle lorsqu'elle est dans le dispositif de contention.
- Ajustez le piston pour permettre aux souris de tourner, mais pas de la tête à la queue pour vous assurer que l’aérosol est inhalé.
- Surveillez en permanence les souris lorsqu’elles sont dans les tubes de retenue. Après avoir positionné le piston, les petites souris (<20 grammes) tentent souvent de tourner la tête à la queue dans les tubes et adoptent une position en U où elles ont du mal à respirer. Ce comportement de rotation est le plus répandu dans les 5 premières minutes de contention ; Après cela, les souris tentent rarement de tourner la tête à la queue.
3. Livraison d’aérosols
- Insérez des bouchons pour boucher les orifices de refoulement de l’unité d’inhalation et activez le générateur d’aérosols, le régulateur de débit d’air comprimé et la pompe à vide de l’unité d’inhalation à partir du logiciel de contrôle du processus.
- Une fois que les lectures du moniteur d’aérosols en temps réel démontrent que la concentration d’aérosols doit atteindre l’équilibre (~30 min, figure 2), commencez à retirer les bouchons et à insérer les tubes de retenue du nez seulement contenant des souris dans l’unité d’inhalation. Répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les souris exposées au médicament soient connectées à l’unité d’inhalation.
REMARQUE : Dans l’exemple d’expérience, le débit d’air total fourni à l’unité d’inhalation par l’intermédiaire du générateur d’aérosol et de l’air de dilution est réglé de manière à fournir un débit de 0,5 L/min à chaque orifice d’exposition d’animaux utilisé. Par exemple, un débit d’air total de 15 L/min suffit pour alimenter chacun des 30 orifices de l’unité d’inhalation. C’est beaucoup plus de débit d’air que ce qui est requis par la ventilation minute des souris, mais un flux d’air plus important est nécessaire pour fournir l’énergie (chute de pression à travers le générateur d’aérosols) pour produire (atomiser/désagglomérer) l’aérosol.
- Une fois que tous les animaux sont chargés dans l’unité d’exposition, allumez les pompes d’échantillonnage à vide connectées au filtre absolu et à l’impacteur en cascade à l’aide du logiciel de contrôle du processus.
- Lorsque toutes les expositions sont terminées, éteignez le générateur d’aérosols et retirez les souris restantes de l’unité d’inhalation.
REMARQUE : Les animaux seront manipulés avec une cagoule de station de changement ou par du personnel portant un masque facial. Une fois l’administration de l’aérosol terminée, les souris sont retirées des tubes et désinfectées après chaque utilisation.
