Un modèle d’interposition aortique chez la souris pour étudier le rejet vasculaire induit par l’allo-immunité

Abstract

Source : Enns, W., et al. Modèle murin d’artériosclérose par rejet vasculaire et de transplantation induite par allo-immunité. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo présente une méthode de génération d’un modèle d’interposition aortique chez la souris pour étudier le rejet vasculaire induit par l’allo-immunité. Après avoir placé une souris donneuse anesthésiée en position couchée, l’aorte abdominale infrarénale (AIA) est soigneusement isolée des structures environnantes. Les vaisseaux ramifiés sont ligaturés et les deux extrémités de l’AIA sont clampées pour empêcher la circulation sanguine avant la résection. Par la suite, l’AIA du donneur est implanté dans une souris receveuse allogénique, et le flux sanguin est rétabli par anastomose pour étudier le rejet vasculaire induit par allo-immunité.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

Utilisez des souris donneuses Balb/cYJ (H2^d) et des souris receveuses C57Bl/6 (H2^b) pour examiner les réactions allogéniques. Les souris sont utilisées pour des expériences entre l’âge de 8 et 12 semaines. Utilisez des souris femelles ou mâles. Les témoins syngéniques sont constitués de segments aortiques provenant de donneurs C57Bl/6 dans des receveurs C57Bl/6.

1. Préparation du donneur et du receveur

REMARQUE : Le donneur et le receveur sont anesthésiés et préparés avant l’intervention afin de minimiser l’ischémie du greffon. Les anesthésiques injectables sont utilisés dans le protocole pour éviter l’obstruction de l’animal par l’équipement nécessaire à l’administration d’anesthésiques inhalés. Cependant, si vous le souhaitez, un anesthésique inhalé est une alternative appropriée. À partir de l’injection initiale des anesthésiques, l’ensemble de la procédure dure environ 90 minutes. Le temps ischémique du greffon est inférieur à 30 min.

1. Anesthésier la souris avec des injections intrapéritonéales de kétamine (100 mg/kg ; 10 mg/ml) et de xylazine (10 mg/kg ; 1 mg/ml). La souris sera sous sédation dans les 10 à 15 min. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en pinçant la partie graisseuse du coussinet plantaire de l’animal. Administrer 1/3 de la dose originale du cocktail anesthésique, au besoin, jusqu’à ce que l’animal ne présente plus de réflexe de sevrage. Surveillez de près la fréquence respiratoire après l’administration de chaque cocktail. Pendant l’opération, évaluez le niveau d’anesthésie toutes les 15 minutes en pinçant la paroi abdominale antérieure avec une paire de pinces. Les souris doivent rester profondément anesthésiées pendant 60 à 90 min.
2. Lubrifiez les yeux de la souris avec une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
3. Rasez les poils le plus près possible de la peau sur la région ventrale abdominale, du milieu du thorax au pubis. Faites particulièrement attention à ne pas entailler la peau. N’utilisez pas de crème dépilatoire car elle peut être absorbée par la peau et pourrait être inflammatoire.
4. Placez l’animal en décubitus dorsal sur une serviette au-dessus de la table chauffante ou du coussin.
5. Nettoyez le site chirurgical avec un gommage préliminaire avec de la chlorohexidine à 2 %. Préparez une grande zone de travail pour maximiser le champ opératoire. Commencez à frotter au centre du site chirurgical et déplacez-vous vers l’extérieur de manière linéaire ou circulaire. Jetez la gaze. Répétez cette procédure au moins 5 fois de plus. Appliquez un tampon de préparation à l’alcool sur la même zone. Une fois que l’alcool est sec, préparez la zone propre avec une solution de bétadine et drapez-la avec de la gaze stérile.

2. Procédure d’anastomose de bout en bout

1. Opération des donateurs
   1. Maintenir une technique aseptique tout au long de l’opération. Nettoyez toutes les surfaces du comptoir et de la table chirurgicale avec une solution de peroxyde d’hydrogène accéléré à 0,5 % avant utilisation. Enveloppez et autoclavez tous les instruments chirurgicaux, les gazes, les champs et les blouses avant de les utiliser. Vérifiez la stérilité des instruments à l’aide d’une bande indicatrice de stérilisateur à vapeur placée dans chaque emballage. Des gants chirurgicaux stériles sont utilisés et jetés entre les chirurgies. Pour plusieurs interventions chirurgicales, stérilisez les instruments chirurgicaux entre les utilisations avec le stérilisateur à billes de verre chaud.
   2. Placez la souris donneuse en décubitus dorsal sur une planche de plexiglas mince et propre enveloppée d’un champ stérile sous le microscope opératoire à un grossissement de 8 à 30X.
   3. Après s’être assuré d’une anesthésie chirurgicale adéquate comme indiqué à la section 1.1, procédez à la chirurgie.
   4. À l’aide de ciseaux stériles, faites une seule incision abdominale longitudinale inférieure médiane, du pubis à l’apophyse xyphoïde.
   5. Ouvrez les parois abdominales pour exposer la cavité à l’aide d’un petit écarteur.
   6. À l'aide d'applicateurs stériles à embout de coton, rétractez doucement les intestins vers le haut vers la gauche de l'animal et recouvrez de gaze imbibée d'une solution saline. Déplacez les organes reproducteurs vers le bas et localisez l’aorte infrarénale et la veine cave inférieure (VCI). Humidifiez périodiquement les tissus exposés avec une solution saline.
   7. À l’aide de la pince médicale n° 5, séparez l’aorte de la VCI, du niveau de l’artère rénale gauche jusqu’à la bifurcation. Utilisez des sutures monofilament de polyamide 10-0 pour ligaturer les petites branches près de l’aorte.
   8. Une fois que l'aorte du donneur a été séparée de la VCI, saturez le récipient de solution saline, couvrez la cavité exposée avec de la gaze humidifiée et placez le donneur dans un endroit stérile. Vérifiez l’état du donneur (fonction respiratoire et cardiovasculaire et profondeur de l’anesthésie) toutes les 15 min. Commencer à opérer le receveur, en isolant l’aorte comme décrit ci-dessous (étapes 2.2.1 à 2.2.7).
   9. Une fois que l’aorte receveuse a été séparée de la VCI et mise de côté, renvoyez le donneur sous le microscope. Croiser (proximale et distale le segment d’intérêt) l’aorte du donneur, à environ 5 mm d’intervalle, avec deux pinces microvasculaires de 4 mm.
   10. À l’aide des microciseaux de Vannas-Tübingen, transectez un petit segment de greffon (3 à 4 mm de long) de l’aorte abdominale.
   11. À l’aide d’une aiguille 5/8 de 25 G fixée à une seringue, rincer l’aorte excisée avec une solution saline héparinée (100 U/ml). Assurez-vous que la pointe de l’aiguille n’entre pas en contact avec le récipient.
   12. Placez l’aorte dans une solution saline héparinée (100 U/ml) sur de la glace et réservez. Toujours sous anesthésie profonde, relâchez les pinces microvasculaires. Euthanasier le donneur par exsanguination.
   13. Implantez le vaisseau donneur dans les 30 minutes suivant l’excision. Bien qu’il soit possible d’utiliser un seul récipient donneur pour plusieurs receveurs en excisant une plus grande longueur de l’aorte, maintenez le temps ischémique à moins de 30 minutes.
2. Opération du destinataire
   1. Maintenir une technique aseptique tout au long de l’opération, comme dans le cas d’une opération donneuse.
   2. Placez la souris receveuse en position couchée sur une mince planche de plexiglas enveloppée d’un drap stérile sous le microscope opératoire à un grossissement de 8 à 30X.
   3. Après s’être assuré d’une anesthésie adéquate, procéder à une intervention chirurgicale lorsque l’animal ne présente pas de réflexe de retrait.
   4. À l’aide de ciseaux stériles, faites une seule incision abdominale longitudinale inférieure médiane, du pubis à l’apophyse xyphoïde.
   5. Ouvrez les parois abdominales pour exposer la cavité à l’aide d’un petit écarteur.
   6. À l'aide d'applicateurs stériles à embout de coton, rétractez doucement les intestins vers le haut vers la gauche de l'animal et recouvrez de gaze imbibée d'une solution saline. Déplacez les organes reproducteurs vers le bas et localisez l’aorte infrarénale et la VCI. Humidifiez périodiquement les tissus exposés avec une solution saline.
   7. Séparez l’aorte de la VCI, du niveau de l’artère rénale gauche à la bifurcation. Utilisez des sutures monofilament en polyamide 10-0 pour ligaturer les petites branches près de l’aorte si nécessaire.
   8. Pince transversale (proximale et distale au segment d’intérêt) l’aorte, distante d’environ 5 mm, avec deux pinces microvasculaires de 4 mm.
   9. À l’aide des microciseaux Vannas-Tübingen, faites une seule aortotomie horizontale et réséquez un petit segment (pas plus de 0,5 mm) de l’aorte abdominale pour accueillir le greffon aortique donneur.
   10. Rincer l’aorte excisée avec une solution saline héparinée (100 U/ml). La greffe aortique du donneur doit être d'une longueur appropriée pour relier les extrémités aortiques transectées du receveur.
   11. Placez le greffon aortique du donneur en position orthotopique et anastomosez l'extrémité du greffon du donneur à l'extrémité du receveur, en faisant correspondre l'orientation anatomique du greffon respective avec celle du receveur.
   12. Saisissez doucement la tunique externe du vaisseau et retournez-la légèrement à l’aide de la pince médicale n° 5. À l'aide de la pince, enfoncez l'aiguille fixée à la suture monofilament de polyamide 10-0 sur toute l'épaisseur de la paroi du vaisseau pour fixer le greffon aortique du donneur au vaisseau réséqué du receveur. Assurez-vous que l'ouverture du récipient n'est pas fermée en raison de coutures involontaires de la paroi arrière du récipient.
   13. Pour les points de suture continus, placez des sutures à 9 heures dans les extrémités supérieure et inférieure du greffon. En commençant par l'extrémité supérieure du greffon à partir de 3 heures, anastomose les extrémités réséquées avec 2 sutures courantes et fixent la suture à la suture de maintien.
       1. Retournez le greffon et continuez la suture jusqu’à la partie dorsale du vaisseau, à la rencontre de la suture d’origine. Fixez sans appliquer beaucoup de pression sur le navire. Répétez la suture pour l’anastomose inférieure.
          Remarque : Les sutures interrompues commencent de la même manière que les sutures continues, sauf que le vaisseau est anastomosé avec trois points de suture séparés entre les sutures de séjour. Le temps d’anastomose est généralement de 20 min.
   14. Une fois l’anastomose terminée, relâchez la pince microvasculaire distale pour permettre au sang rétrograde de circuler et vérifiez s’il y a une fuite des sites anastomosés. S’il y a une fuite, placez immédiatement un point de suture pour fermer le site défectueux. S’il n’y a pas de saignement aux sites, relâchez la pince proximale.
   15. Examinez la greffe et vérifiez qu'il n'y a pas d'obstruction sanguine dans le greffon et les parties proximales et distales du vaisseau du receveur. Un pouls vigoureux dans les vaisseaux du donneur et du receveur indique que le sang circule librement. À l’aide de la paire de pinces, saisissez doucement une extrémité des sutures de hauban et retournez légèrement le vaisseau pour inspecter la paroi arrière du vaisseau.
       note: Il ne doit pas y avoir de plissement de la paroi du récipient aux deux extrémités des sites anastomosés. Une mauvaise circulation sanguine après le retrait des pinces est un signe de thrombose.
   16. Remettez les intestins dans la cavité abdominale à l’aide d’applicateurs à bout de coton.
   17. À l’aide du porte-aiguille Castroviejo et de la pince Graefe, fermez la paroi abdominale avec des sutures en polypropylène 5-0 à l’aide de coutures continues. Fermez la couche cutanée avec les mêmes sutures à l’aide d’une fermeture sous-cutanée.
   18. Administrer Torbugesic (1 mg/kg) i.m. immédiatement après la fin de la greffe.
   19. Donnez immédiatement, dans l'ordre, de l'atipamézole (1 mg / kg), du kétoprofène (5 mg / kg) et une solution de ringer lactate réchauffée par voie sous-cutanée.
   20. Immédiatement après la chirurgie, placez les souris dans une cage chauffée sous une couverture d’eau pendant la nuit (12 heures). Pendant la période de récupération anesthésique, placez les animaux seuls dans un endroit propre, sec et dégagé. Tapissez la cage (autoclave) d’essuie-tout propre et ajustez la température de la couverture d’eau à environ 20 à 22 °C. Fournissez des croquettes sèches et humides à volonté sur le sol de la cage.
       note: Un élément essentiel des soins postopératoires est l’observation de l’animal et l’intervention appropriée, au besoin, pendant la récupération de l’anesthésie et de la chirurgie. L’intensité de la surveillance nécessaire variera selon l’animal et pourrait être plus importante pendant la période de récupération immédiate de l’anesthésie que plus tard dans la récupération postopératoire.
   21. Surveillez continuellement les animaux qui ont subi une anesthésie jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement. L’animal doit être capable de maintenir une décubitus sternal non assisté, et il doit sembler calme et exempt de douleur avant d’être laissé sans surveillance.
   22. Donnez de la buprénorphine (0,1 mg/kg BID) et du kétoprofène (5 mg/kg SID) pendant trois jours, tous deux par voie sous-cutanée.
   23. Surveiller la fonction cardiovasculaire et respiratoire, la température corporelle et la douleur ou l’inconfort postopératoire pendant la récupération de l’anesthésie pendant au moins trois jours. Des soins supplémentaires peuvent être nécessaires, tels que l’administration d’analgésiques et d’autres médicaments et de liquides parentéraux pour minimiser la déshydratation et la perte d’électrolytes.
   24. Évaluez le succès de la chirurgie de transplantation en observant la fonction motrice des membres postérieurs. Le succès complet de la greffe implique un flux sanguin non obstrué vers les membres postérieurs et la queue, qui devrait être immédiat dès le rétablissement de l’animal, et un rétablissement complet sans paralysie des membres postérieurs le deuxième jour.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2B)	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	Souche # 000664
Balb/cBYJ	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	Souche # 001026
Chlorhydrate de kétamine injectable USP 100 mg/ mL	Ketalean	DIN 00612316
Xylazine injectable 20 mg/mL	Rompum	DIN 02169592
Kétoprofène injectable 100 mg/mL	Anafen	DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injectable 10 mg/mL	Torbugesic	DIN 008450000
Buprénorphine injectable 0,3 mg/mL	Reckitt Benckiser	N.B. 5241
Solution injectable stérile de chlorhydrate d’atipamézole	Antiberline	DIN 02237744
Héparine sodique injectable, USP, 1000 unités/mL	McKesson Distribution	DIN 02264315
Onguent ophtalmique naturel Tears	Alcon	DIN 02082519
Stéréomicroscope	Leica	M80
Chlorure de sodium à 0,9 %, stérile	Société Baxter
Solution de Ringer lactate, stérile	Société Baxter
Chlorure de sodium injectable à 0,9 %, stérile, 10 mL	Société Baxter
Tampons de préparation à l’alcool	Loris
Povidone iodée	Bétadine
Gluconate de chlorohexidine à 4 % p/v	Germi-Stat
Monofilament polyamide noir	Instruments AROSurgical	T4A10Q07
Suture, suture 10-0, 70 microns	société
Suture monofilament bleue 5-0, aiguille P3	Éthicon	Référence 8698G
Seringue de 1 ml	Bd	RÉF 309659
Seringue de 10 ml	Bd	RÉF 309604
Seringue à insuline TB 1cc avec 28G 1/2	Bd	RÉF 309309
25G 7/8, aiguille hypodermique	Bd	RÉF 305124
27G 1/2, aiguille hypodermique	Bd	RÉF 305109
Écarteur Colibri - 1,5 cm écarté 4 cm	Outils scientifiques fins	Référence 17000-04
S&T CAF-4 Pince d’application de pince, sans verrouillage	Outils scientifiques fins	Référence 00072-14
Pince Supergrip, S&T	Outils scientifiques fins	Référence 00632-11
Pince médicale n° 5	Outils scientifiques fins	Référence 11253-20
Ciseaux pour bébé Lexer	Outils scientifiques fins	Référence 14078-10
Micro pince Adson dentelée	Outils scientifiques fins	Référence 11018-12
Microciseaux Vannas-Tübingen	Outils scientifiques fins	Référence 15003-08
Micro-pinces, b-1 ; 3,5 mm x 1 mm ; longueur 7 mm	Outils scientifiques fins	Référence 00396-01
Pince Graefe, 10cm 1x2 dents	Outils scientifiques fins	Référence 11054-10
Castroviejo avec serrure et mâchoires en tungstène	Outils scientifiques fins	Référence 12565-14
Stérilisateur de billes de verre chaud	Inotech 250	IS-250 - Steri-250
Gazes non tissées	Progène
Applicateurs à pointe de coton	puritain
Tondeuse à barbe	Wahl
Coussin chauffant	rayon de soleil