Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation chirurgicale, anesthésie et régime d’analgésie
- Placez un champ jetable stérile (45,7 cm x 66 cm) sur la plate-forme chirurgicale. Saisissez doucement la souris, injectez de la kétamine (50 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) par voie intrapéritonéale (i.p) pour l’anesthésie, et injectez 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée pour l’analgésie.
- Assurez-vous de la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils, rasez les poils de toute la région de l’abdomen avec un rasoir et placez la souris sur la plate-forme chirurgicale stérile sous le microscope opératoire à un grossissement de 6 à 10x.
2. Prélèvement de la rate du donneur
- Stérilisez l’abdomen avec un tampon de préparation à l’alcool, fixez les membres avec du ruban chirurgical et faites une incision cutanée verticale médiane de 3 à 4 cm du pubis à l’apophyse xiphoïde avec des ciseaux.
- Rétractez la paroi abdominale à l’aide d’écarteurs stériles fabriqués à partir de trombones. Déplacez les intestins vers le flanc droit de l'abdomen (côté gauche du chirurgien) avec un coton-tige stérile pour exposer la rate. Cautériser la veine gastrique courte attachée à la rate à l’aide d’un cautère stérile à basse température (Figure 1A). Placez un morceau de gaze stérile imbibé d’une solution saline à 37 °C sur la rate pour la garder humide (figure 1B).
- Séparer et mobiliser la veine porte du tissu pancréatique (Figure 1C) en ligaturant les branches de la veine porte (veine pancréaticoduodénale supérieure et veine gastrique droite) ; placer une suture autour de la veine porte distale de la veine splénique (Figure 1D).
- Retournez la rate vers le côté droit pour exposer l’aorte et le tronc cœliaque avec l’artère splénique (Figure 1E). Disséquer et mobiliser l’artère aortique-cœliaque-splénique en ligaturant l’artère hépatique et l’artère gastrique ; placez une suture autour de l’aorte proximale de l’artère cœliaque (Figure 1F-G).
- Injectez 100 unités internationales (UI) d’héparine dans la veine cave inférieure (IVC) pour hépariner tout le corps et attendez 3 min pour vous assurer que l’héparine fait effet. Lister l’aorte proximale à l’artère cœliaque, transecter la veine porte, puis perfuser tout le corps à l’aide de 10 mL de solution saline froide héparinisée (4 °C) (10 mL/20 s) de l’aorte abdominale distale au tronc cœliaque (figure 1H).
- Prélevez le greffon de rate en bloc avec le segment aortique-coeliaque-splénique associé et la veine porte ainsi qu’un segment de la veine splénique et une petite partie de tissu pancréatique. Conservez le greffon dans 5 mL de solution saline à 4 °C avant la transplantation. Euthanasier la souris par luxation cervicale.
3. Plénectomie du receveur et implantation d’une greffe de rate
- Placez un coussin chauffant sur la plate-forme chirurgicale et ajustez la température à 37 °C. Placez un champ stérile (45,7 cm x 66 cm) sur le dessus du coussin chauffant pour créer une plate-forme chirurgicale stérile. Répétez les étapes 2.1 et 2.2 pour la préparation chirurgicale et l’anesthésie. Faites une incision médiane de 3 à 4 cm et rétractez la paroi abdominale comme décrit aux étapes 2.1 et 2.2.
- Déplacez délicatement l'intestin vers le côté droit de la souris à l'aide d'un coton-tige stérile pour exposer la rate du receveur. Lissez la veine splénique et l’artère et enlevez la rate.
- Déplacez délicatement l’intestin vers le côté gauche de la souris et couvrez les intestins de gaze humide (imbibée d’une solution saline stérile à 37 °C). Disséquer et ligaturer les branches lombaires de l’aorte infrarénale et de la VCI ; clamper transversalement l’aorte infrarénale et la VCI à l’aide de deux clamps microvasculaires de 4 mm.
- Placez une suture en nylon 11-0 à travers l’aorte infrarénale (une épaisseur complète) et rétractez-la pour créer une aortotomie elliptique en une seule coupe avec des microciseaux (la longueur doit correspondre au diamètre de l’aorte donneuse, Figure 2A). Percez la VCI à l’aide d’une aiguille de 30 G pour créer une veinotomie elliptique et prolongez l’ouverture jusqu’à la veine porte du donneur à l’aide de microciseaux (figure 2A).
- Éliminer le sang intraluminal ou le caillot sanguin (dans l’aorte et la VCI) avec 500 μL de solution saline héparinée (10 unités/mL).
- Placez la greffe de rate dans le flanc droit de l'abdomen de la souris receveuse ; identifiez soigneusement la coiffe aortique du donneur et la veine porte du donneur. Après vous être assuré que les vaisseaux ne sont pas tordus, recouvrez le greffon de rate avec de la gaze imbibée de sérum physiologique froid (4 °C).
- Reliez le brassard aortique du donneur aux apex proximal et distal de l'aortotomie du receveur à l'aide de deux sutures de maintien (suture en nylon 11-0, comme ci-dessous) (Figure 2B, C). Faites une anastomose avec 2-3 bouchées de sutures continues en nylon 11-0 entre le brassard aortique du donneur et l'aortotomie du receveur (paroi antérieure) (Figure 2D). Retournez la greffe de rate sur le côté gauche du receveur ; faire l'anastomose entre le brassard aortique du donneur et l'aortotomie du receveur (paroi postérieure) (Figure 2E).
- Effectuez une anastomose pour relier la veine porte du donneur à la paroi postérieure de la VCI du receveur, à l'aide de 4 à 5 morsures de sutures continues à l'intérieur de la VCI, puis fermez la suture à l'extérieur de la VCI (Figure 2F,G).
- Relâchez les pinces à récipients et utilisez un coton-tige stérile pour tamponner le saignement jusqu’à ce que la couleur de la rate soit récupérée (Figure 2H).
- Fermez l’abdomen avec une suture synthétique résorbable en vicryl 5-0 selon un motif continu. Fermez la couche de peau avec une suture en nylon 5-0 selon un motif interrompu.
note: Pour les étapes 3.7-3.8, vous pouvez également effectuer une anastomose entre la veine porte du donneur et la VCI du receveur (étape 3.8) ; Faites ensuite une anastomose entre le brassard aortique du donneur et la paroi postérieure de l'aortotomie du receveur, en utilisant 2 à 3 sutures continues à l'intérieur de l'aorte et fermez la suture à l'extérieur de l'aorte.
4. Récupération des animaux
- Injecter 1 mL de solution saline chaude par voie sous-cutanée en 4 endroits distincts (0,25 mL/emplacement) après avoir fermé l’abdomen.
- Gardez la souris dans un incubateur à température contrôlée (30 °C) pendant les premières heures suivant l’opération, surveillez-la jusqu’à ce qu’elle ait repris suffisamment conscience, puis transférez-la dans une nouvelle cage propre avec de la nourriture et de l’eau ordinaires, avec un coussin chauffant (30 °C) sous la cage. Gardez la souris après l’opération dans une cage séparée.
5. Gestion de la douleur post-chirurgicale
- Injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée 24 h et 48 h après la chirurgie pour maintenir le régime d’analgésie.
