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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de stocks quantifiés de glycérol de Bacillus Calmette-Guerin (BCG) danois et de Mycobacterium tuberculosis H37Rv
REMARQUE : Tous les protocoles décrits ont été réalisés dans des conditions de niveau de biosécurité 3 (BSL3).
- Décongeler des stocks de glycérol congelés de souches danoises ou H37Rv de BCG et inoculer 100 μl dans 10 ml de milieu 7H9 complété par Tween-80 0,05 % (v/v) et ADC (albumine, dextrose, catalase) 10 % (v/v).
- Incuber dans des conditions statiques pendant une semaine à 37 °C jusqu’à ce que la culture soit en phase de croissance logarithmique.
- Augmentez l’échelle de la culture bactérienne en transférant la culture de 10 ml dans 200 ml de milieu frais. Incuber pendant 20 jours supplémentaires dans des conditions statiques.
- Transférer dans des tubes à centrifuger de 50 ml et centrifuger pendant 15 min à 2500 x g.
- Jetez les surnageants et remettez en suspension la pastille bactérienne dans le volume résiduel. Ajoutez des billes de verre stériles de 3 mm de diamètre dans chaque tube (10 à 15 par tube).
- Agitez vigoureusement pendant 1 min afin de dissocier les amas bactériens. Remettre en suspension chaque pastille dans 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Tween-80 0,05 % (v/v).
- Laisser les tubes pendant 10 min en laissant les plus grands agrégats bactériens et les billes de verre se déposer.
- Récupérer 9,5 ml de surnageant dans chacun des 4 tubes contenant de petits amas et des bactéries simples et transférer les volumes dans un seul tube à centrifuger frais de 50 ml (volume final récupéré 38 ml). Centrifugeuse pendant 10 min à 400 x g.
- Récupérer 35 ml de surnageant (contenant principalement des bactéries uniques) dans un seul tube à centrifuger frais de 50 ml et ajouter 15 ml de PBS avec du glycérol à 50 % (v/v), en obtenant une concentration finale de glycérol de 15 % (v/v).
- Mélanger délicatement et répartir dans 1 ml d’aliquotes dans des tubes appropriés pour la congélation. Conserver à -80 °C (un lot fournit environ 50 aliquotes de stock de glycérol).
- Pour quantifier les stocks de glycérol, décongelez le glycérol le lendemain de la congélation et effectuez sept dilutions en série de dix fois dans des tubes séparés de 1,5 ml contenant 900 μl de PBS.
- Plaque de 100 μl de chaque dilution dans un milieu solide-gélose 7H10 complété par de l’ADC 10 % (v/v) préparé dans des boîtes de Pétri de 55 mm de diamètre.
- Ajoutez délicatement des billes de verre de 3 mm de diamètre (environ 10 par plaque) et secouez doucement la plaque pour répartir uniformément le volume sur la plaque de gélose. Jetez les perles et scellez la plaque de gélose avec du parafilm.
- Incuber pendant 21 jours à 37 °C et déterminer la concentration bactérienne en comptant les unités formant colonies (UFC) dans les dilutions où les colonies individuelles peuvent être distinguées avec précision.
2. Vaccination des souris
- Décongelez un glycérol BCG pré-quantifié et diluez-le dans du PBS pour préparer deux suspensions. Calculer le volume final en considérant que la dose par animal est de 100 μl pour l’administration sous-cutanée (107 UFC par ml pour la vaccination sous-cutanée) et de 40 μl pour l’administration intranasale (2,5 x 107 UFC pour la vaccination intranasale).
- Utilisez un poste d’anesthésie spécialisé pour les rongeurs afin d’anesthésier les souris avec un mélange d’isoflurane et d’oxygène. Utilisez de l’isoflurane à 5 % pour induire l’anesthésie et à 2 % pour maintenir les souris dans la chambre d’anesthésie. (D’autres méthodes d’anesthésie acceptées peuvent être utilisées).
- Pour l’administration sous-cutanée du vaccin, remplissez une seringue de 1 ml avec une aiguille de 26 G avec 1 ml de suspension bactérienne (10à 7 UFC/ml). Éliminez les bulles d’air.
- Placez une souris anesthésiée sur une surface plane en position couchée à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire et inoculez par voie sous-cutanée 100 μl (106 UFC/dose) de vaccin dans un flanc du dos de la souris. Remettez la souris dans la cage et surveillez-la pour vous assurer qu’elle se remet correctement de l’anesthésie.
- Changez l’aiguille de la seringue entre chaque administration de souris. Éliminez les bulles d’air comme décrit ci-dessus - effectué.
- Pour l’administration intranasale, placez une souris anesthésiée en position couchée à l’intérieur de la capuche.
- À l’aide d’une micropipette, prélever 20 μl de suspension avec 2,5 x 107 UFC/ml. Placez l’inoculum goutte à goutte entre les deux narines jusqu’à ce que tout le volume ait été déposé, en laissant du temps entre les gouttes pour permettre à la souris de respirer le volume.
REMARQUE : les souris peuvent souffrir de détresse respiratoire pendant cette procédure, il faut donc les laisser assimiler chaque goutte avant d’administrer la suivante pour la prévenir autant que possible.
- Remplissez à nouveau la micropipette avec 20 μl supplémentaires et répétez l’opération. Si la souris commence à se réveiller de l’anesthésie après la première inoculation, placez-la dans la chambre d’anesthésie avant la seconde. Remettez la souris dans la cage et assurez-vous qu’elle se remet correctement de l’anesthésie.
3. Provocation intranasale chez la souris avec la souche H37Rv
- Décongeler un glycérol H37Rv pré-quantifié et le diluer dans du PBS pour préparer une suspension bactérienne de 2 500 UFC par ml. Calculer le volume final en considérant que la dose par animal est de 40 μl.
- H37Rv est inoculé par voie intranasale comme décrit aux points 2.5 à 2.7. La dose finale de provocation par souris est de 102 UFC/40 μl.