Génération de la démyélinisation corticale cérébrale généralisée dans un modèle de rat

Résumé

Source : Üçal, M. et al., Modèle de rat de démyélinisation corticale cérébrale généralisée induite par une injection intracérébrale de cytokines pro-inflammatoires. J. Vis. Exp. (2021)

La vidéo montre une méthode de génération d’un modèle de rat avec une démyélinisation corticale cérébrale généralisée. Il s’agit de perturber la barrière hémato-encéphalique en injectant des cytokines pro-inflammatoires dans des souris amorcées avec la protéine de gaine de myéline recombinante. Ce processus facilite l’infiltration des cellules immunitaires, entraînant une démyélinisation corticale cérébrale généralisée.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation du matériel

REMARQUE : L’opération est réalisée dans des conditions aseptiques. Avant de commencer, assurez-vous que tous les instruments chirurgicaux, y compris les forets, sont nettoyés avec un désinfectant approprié.

1. Préparez un mélange d’anesthésiques : 0,02 mg/mL de fentanyl, 0,4 mg/mL de midazolam et 0,2 mg/mL de médétomidine (concentrations finales dans le mélange).
   REMARQUE : Voir la section Discussion respective pour les anesthésiques alternatifs.
2. Préparez un mélange d’antidote : 0,07 mg/mL de flumazénil et 0,42 mg/mL d’atipamézole (concentrations finales dans le mélange).
3. Assemblez le cathéter et le capuchon du cathéter avec l’entrée et la vis. Coupez le cathéter à une longueur de 2 mm à l’aide d’un scalpel (figure 1).
   REMARQUE : N’utilisez pas de ciseaux pour cela car ils compriment et déforment la forme de la section transversale circulaire de l’extrémité du cathéter.

2. Préparation chirurgicale

1. Anesthésier le rat par une administration intrapéritonéale du mélange anesthésique (1,5 mL/kg de poids corporel).
2. Rasez la tête du rat entre les oreilles à l’aide du rasoir électrique. Placez une couverture homéothermique sur le cadre stéréotaxique avant de positionner l’animal, afin d’éviter l’hypothermie tout au long de la chirurgie.
3. Immobilisez la tête du rat dans le cadre stéréotaxique à l'aide des barres d'oreille et de la plaque de morsure, en veillant à ce que la tête soit horizontale et stable. Vérifiez la stabilité en exerçant une pression sur le crâne avec le doigt ou une pince.
   REMARQUE : Une fixation lâche et un positionnement non horizontal à l’intérieur du cadre stéréotaxique peuvent entraîner un écart par rapport aux coordonnées prévues.
4. Appliquez des gouttes oculaires lubrifiantes pour prévenir la sécheresse de la cornée pendant la chirurgie. Couvrez les yeux avec un matériau opaque pour éviter toute exposition chirurgicale à la lumière.
5. Nettoyez la zone rasée en alternant l’application de 70 % d’éthanol et de 10 % de complexe povidone-iode.
   REMARQUE : Suivez toutes les mesures de précaution pendant la chirurgie pour éviter l’infection. L’opération est réalisée dans des conditions aseptiques. Si l’asepsie est brisée, le matériau contaminé doit être remplacé.

3. Implantation du cathéter

1. Faites une incision longitudinale d’environ 2 cm de longueur au milieu de la peau de la tête. Utilisez des pinces bulldog pour maintenir la peau sur les côtés. Pour une vue d’ensemble de ces étapes, reportez-vous à la figure 2.
2. Prélevez le sang à l’aide d’un applicateur à embout coton.
3. Retirez le périoste du crâne. Nettoyez le tissu avec l’applicateur à coton-tige et exposez l’os du crâne. Laissez sécher le crâne pendant environ 1 min.
4. Identifiez les repères anatomiques, Lambda, Bregma et la suture médiale. Avec la perceuse installée sur le cadre stéréotaxique, positionnez la pointe de la perceuse sur le Bregma comme point de départ. Se déplacer de 2 mm vers l’arrière du Bregma et se déplacer latéralement de ~2,4 mm vers la suture médiale.
5. Percez un trou de 0,5 mm de diamètre pour le cathéter à cette position. Soufflez doucement pour enlever la poussière d’os.
   REMARQUE : Il est important que la dure-mère reste intacte pendant le perçage. Pour ce faire, 1) utilisez une perceuse qui peut être installée sur le cadre stéréotaxique, 2) inspectez fréquemment le trou pendant le perçage et 3) creusez par petites étapes. Si une pression trop importante est appliquée sur le crâne, la pointe de la perceuse continuera à pénétrer et endommagera le cerveau lorsque le crâne est complètement pénétré.
6. Percez 3 autres trous (~1,3 mm de diamètre) pour les vis d’ancrage à quelques millimètres du premier trou. Soufflez doucement la poussière d’os.
   REMARQUE : Sélectionnez des emplacements de vis d’ancrage qui offrent suffisamment d’espace pour le dessus du cathéter (~2 mm de diamètre) et les sommets des vis d’ancrage (~1 mm).
7. Enlevez la poussière d’os par irrigation avec environ 1 à 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile ou de solution saline physiologique à l’aide d’une seringue. Nettoyez le crâne. Serrez les vis d’ancrage de 2 à 3 tours complets.
   REMARQUE : Les vis d’ancrage sont nécessaires pour stabiliser l’installation en maintenant le ciment dentaire et, par conséquent, le cathéter en place. Lors du serrage d’une vis d’ancrage, assurez-vous qu’elle n’est pas facilement amovible en la soulevant doucement vers le haut à l’aide d’une pince. Étant donné que l’implantation du cathéter lui-même provoque un traumatisme tissulaire, une lésion supplémentaire de la dure-mère lors du perçage ou du serrage des vis d’ancrage entraînera de multiples lésions traumatiques et entravera éventuellement la comparabilité au sein d’un groupe. Serrez d’abord les vis d’ancrage et insérez le cathéter en dernier.
8. Insérez le cathéter de 2 mm de longueur dans le premier trou, perpendiculairement à la surface du crâne. Tout en maintenant le cathéter en place, appliquez un peu de ciment dentaire et laissez-le polymériser avec une brève exposition (~5 s) à la lampe de polymérisation dentaire pour stabiliser le cathéter, permettant l’utilisation des deux mains à l’étape suivante.
   prudence: Lorsque vous travaillez avec une lampe à polymériser dentaire, évitez de regarder directement la pointe ou la lumière réfléchie par la zone d’application, car la haute intensité de cette lumière peut causer des lésions rétiniennes. Utilisez des lunettes de protection appropriées.
9. Appliquez plus de ciment dentaire autour du cathéter, ancrez les vis et solidifiez le ciment dentaire avec la lampe à polymériser dentaire (~15 - 30 s). Confirmez le durcissement du ciment avec la pointe d’une pince.

4. Fermeture de la plaie et antagonisation de l’anesthésie

1. Fermez la peau de la tête à l’aide de sutures résorbables, en avant et en arrière du cathéter.
   REMARQUE : Étant donné qu’il y aura une configuration bosselée sur le crâne à la fin de l’implantation, faites la fermeture de la plaie en conséquence. Soulever trop la peau entraînera une gêne pour l’animal.
2. Injecter le mélange d’antidote par voie sous-cutanée (1,5 ml/kg de poids corporel) à l’aide d’une seringue de 1 ml avec une aiguille de 26 g.
3. Administrer de l’enrofloxacine (2,5 %) par injection sous-cutanée (7,5 mg/kg de poids corporel) pour un traitement antibiotique prophylactique. Administrer du carprofène (1 mg/mL ; 5 mg/kg de poids corporel) et de la buprénorphine (1,2 mg/kg) pour soulager la douleur par injection sous-cutanée.

5. Soins postopératoires et médicaments

1. Remettez l’animal dans la cage modifiée et gardez-le en observation pendant 1 à 3 h, avec une application de lumière infrarouge pour éviter l’hypothermie. Observez et repositionnez constamment l’animal toutes les 5 à 10 minutes jusqu’à la récupération postopératoire. Prenez des précautions particulières pour éviter une exposition constante à la lumière des yeux jusqu’à la guérison.
2. Répéter l’administration d’enrofloxacine (7,5 mg/kg de poids corporel) et de carprofène (1 mg/mL ; 5 mg/kg de poids corporel) par injections sous-cutanées le lendemain de la chirurgie. La buprénorphine n’a pas besoin d’être rafraîchie car le traitement précédent est efficace pendant 72 heures.

6. Préparation du mélange de vaccination (au plus tôt 14 jours après l’implantation du cathéter)

REMARQUE : Placez les seringues sur de la glace pendant la procédure de préparation.

1. Connectez deux seringues en verre Luer lock de 10 ml aux bras courts d’un robinet d’arrêt à 3 voies et fermez la troisième sortie avec le bras long.
2. Assurez-vous que les raccords sont bien fixés et qu’ils ne fuient pas : ajoutez environ 4 ml de PBS stérile dans la seringue ouverte tout en tenant le piston 2. Insérez le piston 1 et poussez les deux pistons d’avant en arrière tout en vérifiant les fuites. S’il n’y a pas de fuite, jetez le PBS et retirez à nouveau le piston 1.
3. Pipeter 1 mL d'adjuvant de Freund incomplet (IFA) et 50 μg de glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline recombinante (rMOG_1-125) ensemble et ajuster le mélange à un volume final de 2 mL avec du PBS stérile (pH 7,4) dans un tube approprié.
   REMARQUE : En raison des pertes d’émulsion sur les pointes ou les parois des seringues lors de la préparation, préparez un volume plus important que prévu pour l’administration. Il est également plus pratique de se préparer pour plus d’un animal à la fois.
4. Placez le mélange dilué d’IFA et de rMOG_1-125 dans la seringue ouverte. Insérez doucement le piston tout en maintenant une pression lâche sur le piston opposé (Figure 3A).
5. Émulsionnez l’inoculum en le conduisant d’une seringue à l’autre en poussant les pistons d’avant en arrière jusqu’à ce qu’il soit blanc et visqueux (Figure 3B).
6. Fixez une seringue Luer lock de 1 mL sur le bras court ouvert du robinet d’arrêt à 3 voies et remplissez-la d’inoculum (figure 3C). Répartir tout l’inoculum dans des seringues de 1 ml. Gardez-le sur de la glace jusqu’à l’injection. Administrer le mélange le jour de la préparation.

7. Immunisation

1. Anesthésier le rat avec de l’isoflurane dans une chambre (~2 min, mélangé à de l’oxygène 2 L/min) puis maintenir l’anesthésie à travers un masque (mélangé à de l’oxygène 1,5 L/min).
2. Injecter 200 μL d’inoculum par voie sous-cutanée à la base de la queue à l’aide d’une aiguille de 21 G.
   REMARQUE : Administrez l’injection lentement car la solution est visqueuse.

8. Injection de cytokines intracérébrales

1. Ajustez la longueur de la canule de connecteur (2 mm). (Voir la figure 4 pour les étapes de préparation.)
2. Remplissez une seringue de 1 mL avec le mélange de cytokines (500 ng/μL de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha), 300 U/μL d’interféron gamma de rat recombinant (IFN-gamma) dans du PBS stérile). Connectez la seringue à une canule de connecteur. Remplissez la canule avec le mélange de cytokines. Évitez les bulles.
3. Montez la seringue sur le pousse-seringue programmable et programmez-la pour injecter 0,2 μL/min (Figure 5A). Démarrez la pompe et maintenez-la en marche afin d’éviter la formation de bulles d’air à l’extrémité de la canule.
   REMARQUE : La vitesse d’injection doit tenir compte du diamètre intérieur de la seringue spécifique utilisée ; Par conséquent, le diamètre de la seringue doit être enregistré lors de la mise en place de la pompe.
4. Anesthésier le rat avec de l’isoflurane dans une chambre (~2 min, mélangé à 2 L/min d’oxygène), puis maintenir l’anesthésie à l’aide d’un masque (mélangé à 1,5 L/min d’oxygène) (figures 5B et 5C). Appliquez des gouttes ophtalmiques lubrifiantes car l’animal sera anesthésié pendant au moins 30 min.
5. Retirez le capuchon du cathéter avec l’entrée. Insérez la canule de connecteur dans le cathéter, vissez-la et serrez-la (Figures 5D et 5E).
   REMARQUE : Ne le serrez pas trop, car cela détruirait l’extrémité supérieure du cathéter.
6. Laisser l’injection se poursuivre pendant 10 min (le volume total d’injection étant de 2 μL). Arrêtez la pompe. Laissez la canule à l’intérieur du cathéter pendant 20 min pour permettre au volume injecté de se diffuser complètement.
7. Dévissez la canule du connecteur et retirez-la lentement pour éviter un effet de vide.
8. Remettez le capuchon du cathéter avec l’entrée et vissez-le. Laissez l’animal se remettre de l’anesthésie dans une cage.

Résultats

Figure 1 : Préparation du cathéter. (A et B) La canule de guidage et la canule factice (capuchon de cathéter avec entrée) sont assemblées et vissées. (C) Ensuite, le cathéter est coupé à 2 mm à l’aide d’un scalpel. L’observation microscopique a montré que l’utilisation de ciseaux à cette fin déforme la forme circulaire de l’extrémité de la can...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Rats Agouti noirs mâles adultes (300 ±25 g)
Fentanyl	Hameln pharma plus, Allemagne		Sous forme de citrate de fentanyl, 50 μg/ml
Le midazolam	ERWO Pharma, Autriche	50039017	5 mg/ml
Médétomidine	Orion Pharma, Finlande		Comme chlorhydrate de méthétomidine, 1 mg/ml
Flumazenil	Roche, Suisse		0,1 mg/ml
Atipamezol	Orion Pharma, Finlande		Sous forme de chlorhydrate d’atipamézol, 5 mg/ml
10 % complexe povidone-iode	Mundipharma, Autriche
Ciment dentaire	Heraeus Kulzer, Allemagne	Référence 6603 7633
Solution saline physiologique	Fresenius Kabi, Autriche		0,9 % de NaCl
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma-Aldrich, Allemagne	Réf. P3813
L’isofluorane	AbbVie, Autriche
Gouttes oculaires lubrifiantes	Thea Pharma, Autriche
70 % d’EtOH	Merck, Allemagne	1070172511	L’éthanol absolu a été dilué dans du jdH2O pour une préparation à 70 % v/v
2,5 % d’enrofloxacine	Bayer, Allemagne		Antibiotiques prophylactiques
Carprofène	Pfizer, États-Unis		Analgésiques, 50 mg/ml
Préadolescent-20	Sigma-Aldrich, Allemagne	Réf. P9416
Pentobarbital	Richter Pharma, Autriche		Pentobarbital sodique, 400 mg/ml
Interféron gamma	PeproTech, États-Unis	400-20
Facteur de nécrose tumorale alpha	R&D Systems, États-Unis	Référence 510-RT-050/CF
rMOG1-125	produit propre au Centre de médecine moléculaire, Institut Karolinska, Suède		Glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline de rat recombinante, acides aminés 1-125 de l’extrémité N-terminale, également disponible dans le commerce : AnaSpec, AS-55152-500, États-Unis
Adjuvant de Freund incomplet	Sigma-Aldrich, Allemagne	F5506
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich, Allemagne	A9576
Solution de substrat de peroxydase	Laboratoires Vector, États-Unis	SK-45000
Cadre stéréotaxique	David Kopf Instruments, États-Unis
Cathéters adaptés à l’IRM	PlasticsOne, États-Unis	8IC315GPKXXC
Canules factices	PlasticsOne, États-Unis	8IC315DCNSPC
Vis en plastique, adaptées à l’IRM	PlasticsOne, États-Unis	Référence 8L080X093N01
Canule de connecteur	PlasticsOne, États-Unis	Référence 8IC313CXSPCC
Tournevis avec pointe de 2 mm
Foret avec extension d’arbre flexible	Proxxon, Allemagne	N° 28 472, N° 28 706, N° 28 620,
Mèche, ronde, 0,5 mm	Hager & Meisinger, Allemagne	REF310 104 001 001 009
Mèche, torsadée, 1,3 mm	Hager & Meisinger, Allemagne	REF350 104 417 364 013
scalpel	Braun, Allemagne	Réf. BB510
Manche de scalpel	Outils scientifiques fins, Allemagne	Référence 91003-12
Applicateur d’embout en coton	Henry Schein Medical, Autriche	Référence 900-3155
Ciseaux chirurgicaux	Outils scientifiques fins, Allemagne	14101-14, 14088-10
Pinces chirurgicales	Outils scientifiques fins, Allemagne	11002-12, 11251-35
Pinces Bulldog	Outils scientifiques fins, Allemagne	Référence 18050-35
Couverture homothermique	TSE systems, Allemagne
Lampe infrarouge	Beurer, Allemagne	616.51
Lampe à polymériser dentaire	Guilin Woodpecker Medical, Chine
Suture résorbable	Johnson & Johnson, Belgique	V792E
Pousse-seringue programmable	World Precision Instruments, États-Unis	AL-1000
Gants d’examen
Blouse chirurgicale
Rasoir électrique	Aesculap, Allemagne	GT420
Vaporisateur d’anesthésique volatil	Rothacher Medical, Suisse	CV 30-301-D
Source d’oxygène pour vaporisateur d’anesthésique volatil	Air Liquide, Autriche	19 113
Chambre d’anesthésie volatile	Rothacher Medical, Suisse	Réf. PS-0347
Masque d’anesthésie pour rats	Rothacher Medical, Suisse	PS-0307-A
Seringue de 1 ml	Codan, Danemark	RÉF 62.1612
Aiguille d’injection de calibre 26	Braun, Allemagne	4657683
Aiguille de calibre 20 pour l’injection de cytokines et l’immunisation	Braun, Allemagne	4657519
Seringues en verre à embout Luer Lock	Poulten & Graf, Allemagne	7.140-37
Robinet d’arrêt à 3 voies	Becton Dickinson, Suède	Référence 394600
Incubateur 37°C	Kendro, Allemagne	50042301
Micropipettes	Gilson, États-Unis	F167350