Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Stérilisation
- Désinfectez les pinces avant le prélèvement des têtes en prenant des pinces propres et en effectuant une stérilisation à la chaleur sèche dans un four à 200 °C pendant 1 h. Autoclavez toute la verrerie à 121 °C pendant 15 minutes avant utilisation.
- Effectuer tous les travaux décrits dans une armoire de microbiologie de classe 2. Préparez tous les réactifs conformément aux instructions du fabricant.
2. Prélèvement d’échantillons
- Dans l’abattoir, les agneaux Swaledale ont été abattus par étourdissement à l’électricité ou à l’aide d’un pistolet percuteur et exsangés. Recueillir les têtes d’agneau au plus tard 4 heures après l’abattage.
3. Préparation des têtes
- Désinfectez la partie frontale de l’agneau en versant environ 100 ml de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm sur la zone de l’échantillon. Rasez la partie frontale de la tête à l’aide d’une tondeuse électrique et lavez la zone avec 200 ml de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm.
- Essuyez la zone avec de l’éthanol et du rouleau bleu et couvrez la zone de l’échantillon avec de la crème dépilatoire pendant 35 min. Grattez doucement la crème dépilatoire à l’aide d’un outil de grattage et évaluez la zone de l’échantillon. S’il reste une quantité importante de poils, répétez le processus d’épilation.
- Utilisez 200 ml supplémentaires de solution de dioxyde de chlore pour rincer la zone, puis rincez à l’éthanol et essuyez avec un rouleau bleu.
- À l’aide d’un poinçon de biopsie stérile de 8 mm, découper des échantillons de peau de 8 mm dans la zone préparée. Prélever les échantillons à l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel à 15 lames, en veillant à ce que toute la graisse cutanée soit éliminée.
- Placez les échantillons dans un bocal stérile de 0,5 L rempli d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, puis transférez-les dans des tubes stériles de 50 ml contenant 50 ml de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm, retournez deux fois et laissez stériliser pendant 30 min.
- Retirer les échantillons de la solution de dioxyde de chlore et les laver en les plaçant dans un tube de 50 mL rempli de 40 mL de PBS stérile. Une fois lavé, placez chaque échantillon de peau dans un puits séparé d’une plaque à 24 puits.
- Ajouter 350 μL de milieu préchauffé tout en maintenant l’échantillon à l’interface air-liquide. La composition du milieu est la suivante : milieu MK (Medium 199 avec sels de Hanks, L-glutamate et 1,75 mg/mL de bicarbonate de sodium) et F12 de Ham dans un rapport de 1:1, avec ajout de sérum de veau fœtal (FBS, 10 % v/v), de facteur de croissance épidermique (EGF, 10 ng/mL), d'insuline (5 μg/mL), de pénicilline-streptomycine (100 U/mL), et l’amphotéricine B (2,5 μg/mL).
- Scellez les plaques à 24 puits avec un joint à plaque perméable aux gaz et incubez à 37 °C dans un incubateur de tissus humidifié à 5 % de CO2 pendant jusqu’à 24 h.
4. Maintenance des échantillons de peau
- Après l’incubation, retirer le milieu de culture et rincer les échantillons dans 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile. Ajoutez un milieu sans antibiotiques à chaque échantillon et incubez à 37 °C dans un incubateur de tissus humidifiés à 5 % de CO2 pendant 24 h pour éliminer les antibiotiques résiduels dans l’échantillon.
- Si une turbidité ou une infection fongique se développe dans le milieu sans antibiotiques après 24 heures, jetez l’échantillon.
5. Préparation de l’inoculum
- Préparez un tube de 50 ml avec 10 ml de bouillon de soya tryptique stérile. Prenez une plaque de gélose fraîche de S. aureus et utilisez un écouvillon pour transférer plusieurs colonies dans le bouillon. Incuber pendant 18 h à 37 °C à 150 tr/min.
- Centrifuger à 4 000 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 10 mL de PBS stérile. Répétez deux fois l’opération pour assurer un lavage adéquat des cellules.
- Ajuster l’inoculum à 0,6 OD600 dans le PBS stérile. Confirmer la charge d’inoculum en effectuant un dénombrement manuel des germes viables.
6. Infection des échantillons de peau
- Préparez une plaque fraîche à 24 puits avec 400 μL de milieu préchauffé sans antibiotiques et ajoutez les inserts à 24 puits à l’aide d’une pince stérile.
- Retirez le milieu des échantillons de peau, lavez-le avec 500 μL de PBS stérile et retirez-le. À l’aide d’une pince stérile, maintenez doucement l’échantillon au fond du puits.
- Utilisez une biopsie à l’emporte-pièce de 4 mm pour faire un lambeau central de la plaie, en perçant jusqu’à une profondeur approximative de 1 à 2 mm. Ensuite, à l’aide d’un scalpel à 15 lames et d’une pince à dents stériles, retirez la couche supérieure du lambeau de la plaie. La variabilité des dimensions de la plaie peut affecter l’issue de l’infection et les unités de formation de colonies (UFC) finales.
- Une fois que tous les échantillons ont été blessés, transférez-les dans les inserts à 24 puits à l’aide d’une pince stérile. Pipeter 15 μL de l’inoculum bactérien dans le lit de la plaie. Ensuite, incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur de tissus humidifié à 5 % de CO2.
- Si des périodes d’incubation plus longues sont nécessaires, retirez le milieu et remplacez-le par un milieu frais toutes les 24 h et incubez dans les mêmes conditions.
