Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Purification et expansion des cellules NK humaines
- Isolez les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de Buffy Coat.
- Appliquer 35 mL d’échantillon de couche leucocytaire sur 15 mL de Ficoll-Paque.
- Centrifuger à 400 x g pendant 20 minutes sans frein et récupérer le PBMC de l’interface.
- Lavez les PBMC récupérés trois fois en ajoutant au moins un volume égal de PBS, en centrifugeant à 400 x g pendant 5 minutes et en aspirant le lavage PBC. Les cellules NK peuvent être isolées à ce stade par RosettesSep.
- Développer les cellules NK en stimulant avec des cellules nourricières 10 x 106 mbIL21 irradiées aux jours 0, 7 et 14. Remplacer le milieu par un IPRP frais contenant 10 % de FBS, 1 % de glutamine, 1 % de pénicilline streptomycine et 100 UI/mL d’IL-2 pour tout le volume de milieu tous les deux jours.
2. Conception et sélection de l’ARNg
- Choisissez les loci génomiques spécifiques à cibler, à l’aide d’outils en ligne, par exemple, NCBI, Ensemble.
exemple.
Description : Facteur de croissance transformant récepteur bêta 2 (TGFBRR2) ectodomaine
Voir l’enregistrement : PF08917
Voir InterPro : IPR015013
Position : 49 - 157 aa
Séquence ciblée : Exon 4 du gène TGFBR2 (ENSG00000163513)
- Pour concevoir les ARNg, utilisez des outils Web de conception CRISPR tels que http://crispr.mit.edu et « Benchling ».
- Entrez la séquence d’ADN choisie à l’étape 2.1. Choisissez l’homme (hg 19) comme génome cible. Les guides CRISPR (20 nucléotides suivis d’une séquence de motif adjacent au protospacer (PAM) : NGG) seront balayés à partir de la séquence saisie précédemment. Il montre également les correspondances hors cible possibles dans tout le génome sélectionné.
- Choisissez les trois meilleurs ARNg qui ont le score le plus élevé, en fonction de leurs taux cibles et hors cible. Par exemple, le tableau 1 montre les ARN CRISPR conçus pour cibler l’exon 4 du gène TGFBR2 suggérés par les outils Web de conception CRISPR.
- Commandez les ARN CRISPR en tant qu’ARNc spécifiques à la séquence synthétique.
- Ordonner à un ARN conservé et transactivateur (ARNtracr) d’interagir par homologie partielle avec l’ARNcr.
3. Amorces de dépistage par délétion de conception
- Concevez des amorces couvrant les sites de clivage de l’ARNg pour le test de mutation T7E1.
- Utilisez des amorces à au moins 100 pb du site de clivage prédit pour vous assurer que de petites insertions-délétions (indels) au site cible de l’ARNsg apparaîtront sur un gel d’agarose à 1,5 % après le test de mutation. Le tableau 2 montre les amorces utilisées pour amplifier l’ectodomaine TGFBR2.
4. Transduction des cellules NK primaires humaines et expansées
Remarque : La transduction des éléments Cas9/RNPs en NK se fait par électroporation à l’aide du système 4D comme suit.
- Préparation des cellules
- Pour les cellules NK primaires, incuber des cellules NK fraîchement isolées dans un milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) en présence de 100 UI/mL d’IL-2 pendant 4 jours et effectuer l’électroporation au jour 5. Remplacez le support tous les deux jours comme décrit précédemment et la veille de la transduction.
- Pour les cellules NK expansées, stimulez les cellules au jour 0 avec des cellules nourricières irradiées dans un rapport de 1:1 et effectuez l’électroporation au jour 5, 6 ou 7. Remplacez le support tous les deux jours comme décrit précédemment et la veille de la transduction.
- Le jour de l’électroporation, préparer une fiole T25 remplie de 8 mL de RPMI frais contenant 100 UI/mL d’IL-2 pour les cellules subissant une électroporation et pré-incuber des fioles dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
note: Les cellules décongelées ou les cellules qui ont subi une 2e ou 3e stimulation peuvent être électroporées à tout moment après leur récupération comme décrit.
- Prendre 3 - 4 × 106 cellules par condition pour 26 μL de mélange de transduction.
note: Une très forte concentration de cellules NK dans une solution d’électroporation augmente le taux de transduction.
- Lavez les cellules 3 fois avec du PBS pour éliminer tout FBS, qui contient généralement une activité RNase. Faites-les tourner à chaque fois à 300 x g pendant 8 minutes.
note: Considérons 7 conditions d’électroporation pour Cas/RNP en tant qu’ARNg unique (ARNg1, ARNg2, ARNg3) et une combinaison de deux ARNg (ARNg1+ARNg2, ARNg1+ARNg3, ARNg2+ARNg3) et d’un contrôle sans Cas9/RNPs.
- Former l’ARNcr :ARNtraceur/complexe
- Remettre en suspension les ARNc (ARNg1, ARNg2 et ARNg3) et l’ARNtraceur dans une solution 1x TE jusqu’à des concentrations finales de 200 μM. Mélanger 2,2 μL de chaque ARNg de 200 μM avec 200 μM d’ARNg comme indiqué dans le tableau 3.
- Chauffer les échantillons à 95 °C pendant 5 minutes et les laisser refroidir sur la paillasse à température ambiante (15 - 25 °C). Stockez les ARN remis en suspension et l’ARNcr : ARNtra/complexe à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
- Former le RNP complex
Remarque : Pour gagner du temps, formez le complexe RNP lors de l’étape de lavage 4.1.5.
- Pour une réaction duplex unique ARNcr :ARNRtracr, diluer l’endonucléase Cas9 à 36 μM, comme le montre l’exemple du tableau 4.
- Pour la transduction combinée des duplex ARNcr :ARNtracr, diluez l’endonucléase Cas9 à 36 μM comme le montre l’exemple du tableau 5.
- Ajouter l’endonucléase Cas9 à l’ARNcr : l’ARNtracr se double lentement tout en faisant tourner la pointe de la pipette, sur 30 s à 1 minute.
- Incuber le mélange à température ambiante pendant 15 à 20 min. Si vous n’êtes pas prêt à utiliser le mélange après l’incubation, conservez le mélange sur de la glace jusqu’à utilisation.
- électroporation
- Ajoutez tout le supplément à la solution d’électroporation P3 et conservez-la à température ambiante.
- Remettre en suspension la pastille de cellule (3 - 4 × 106 cellules de l’étape 4.1.5) dans 20 μL de solution d’électroporation primaire 4D P3. Évitez les bulles d’air lors du pipetage.
Remarque : Les cellules ne doivent pas être laissées longtemps dans la solution P3.
- Ajouter immédiatement 5 μL de complexe RNP (étape 4.3) à la suspension cellulaire.
- Ajoutez 1 μL d’amplificateur d’électroporation Cas9 de 100 μM au mélange Cas9/RNP/cellules.
- Transférer le mélange Cas9/RNP/cellules dans des bandes d’électroporation de 20 μL.
- Tapotez doucement les bandes pour vous assurer que l’échantillon recouvre le bas des bandes.
- Démarrez le système d’électroporation 4D et choisissez le programme EN-138.
Table 1. Trois ARNg conçus pour cibler l’exon 4 de l’ectodomaine TGFBR2 en tant qu’ARNc synthétique.
| N° D’ARNG | Séquence d’ARNg | Commandé en tant qu’ARNc synthétique |
| ARNg1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | /AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrGrUrGrGrUrUrUrGrUrGrGrUrGrUrGrCrUrGrCrU/AltR2/ |
| ARNg2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | /AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArGrArGrGrCrUrCrGrUrUrUrUrGrArGrGrCrUrUrUrGrCrU/AltR2/ |
| ARNg3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | /AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/ |
Tableau 2. Amorces utilisées pour amplifier le gène de l’ectodomaine TGFBR2
| TGFBR 2 ectodomaine Amorces FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomain Primer REV | 5 GGG CCT BÂILLON AAT CTG CAT TTA 3 |
Table 3. Former le complexe ARNcr :ARNtracr/tracr à l’aide d’ARN 200 μM
| composant | Montant (uL) |
| ARNcr 200 μM | 2.2 |
| ARN traceur 200 μM | 2.2 |
| Tampon IDTE | 5.6 |
| Produit final | 10 |
Tableau 4. Pour une réaction duplex simple ARNcr :ARNtracr, diluer l’endonucléase Cas9 à 36 μM.
| composant | Quantité (μL) |
| Pbs | 1 |
| crRNA :tracrRNA duplex (à partir de l’étape 4.2) | 2 (200 pmol) |
| endonucléase Alt-R Cas9 (stock de 61 μM) | deux |
| Volume total | 5 UL |
Tableau 5. Pour la transduction combinée de l’ARNcr :les duplex de l’ARNtracr diluent l’endonucléase Cas9 à 36 μM.
| composant | Quantité (μL) |
| Pbs | 1 |
| ARNcr :ARNRtracr duplex (ex. ARNg1) | 1 (100 pmol) |
| ARNcr :ARNtracr duplex (ex. ARNg2) | 1 (100 pmol) |
| endonucléase Alt-R Cas9 | deux |
| Volume total | 5 μL |
