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1. Génération de vaccins antigrippaux vivants atténués recombinants par génétique inverse
REMARQUE : Le protocole détaillé pour la génération de virus grippaux recombinants par génétique inverse a été décrit par des études antérieures et n’entre pas dans le cadre du présent rapport. En bref, le sauvetage des vaccins antigrippaux adaptés au rhume (VCA) se fait dans une enceinte de classe de biosécurité II sous confinement de niveau de biosécurité 2 (BSL2) et comprend les étapes décrites ci-dessous.
- Produire un vaccin antigrippal réassorti adapté au rhume en utilisant comme toile de fond la souche A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), ainsi que l’hémagglutinine (HA) et une neuraminidase modifiée (NA) de la souche A/PR/8/34 (H1N1) (figure 1A). La modification du gène NA consiste en un remplacement par PCR d’une séquence conservée dans la tige protéique (résidus 65 à 72) par une courte séquence d’ADNc codant pour le peptide SIINFEKL dérivé de l’ovalbumine de poulet (OVA) (Figure 1B). Le peptide SIINFEKL est un peptide hautement immunodominant dans le contexte de la réponse restreinte du CMH H-2b de classe I des souris C57BL/6.
- Boîte 106 cellules 293T par puits dans des plaques à 6 puits utilisant du DMEM 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) complété par 1 % de pénicilline/streptomycine (P/E).
- Préparer le mélange de transfection plasmidique : Ajouter 1 μg de chacun des plasmides codant pour les ADNc PB2, PB1, PA, NP, M, NS de la souche grippale A/Ann Arbor/6/60 et 1 μg des plasmides codant pour le NA-SIINFEKL et HA pour la souche A/PR/8/34. Ajouter un milieu essentiel minimal Opti-minimal préchauffé (Opti-MEM) (15 μl pour un volume final de 100 μl/puits).
- Incuber le mélange de transfection pendant 30 min à RT.
- Ajouter 100 μl de mélange de transfection et incuber pendant 16 heures à 37 °C et 5 % de CO2.
- Changer le milieu cellulaire avec DMEM 0,3 % BSA, 1 % P/E à 33 °C et 5 % CO2 pendant 5 heures.
- Ajouter 10à 6 cellules de rein canin de Madin-Darby (MDCK) permissives pour la grippe dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) contenant 1 μg/ml de trypsine provenant du pancréas bovin traité avec de la L-1-Tosylamide-2-phényléthylchlorométhylcétone (TPCK-trypsine). Maintenir les co-cultures 293T-MDCK pendant 2 à 3 jours à 33 °C et 5 % de CO2.
- Recueillir les surnageants des co-cultures cellulaires MDCK-293T et éliminer par centrifugation à 260 x g pendant 5 min.
