Un modèle de co-culture tridimensionnelle de lymphocytes T infiltrants dans des sphéroïdes tumoraux

Résumé

Source : Lin, Y., et al. Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T en culture 3D. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente une méthode permettant d’établir une co-culture tridimensionnelle de sphéroïdes tumoraux et de lymphocytes T. Un moulage à l’agarose avec des micropuits contenant des sphéroïdes tumoraux est préparé, suivi de l’ajout de lymphocytes T. Après l’incubation, cette configuration permet d’étudier l’interaction des lymphocytes T avec les sphéroïdes tumoraux dans un environnement tridimensionnel contrôlé.

Protocole

1. Génération de sphéroïdes

1. Préparez et autoclavez de l’agarose à 2 % dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (p. ex., 1 g d’agarose dans 50 ml de 1 x PBS) et autoclave des moules en caoutchouc à 35 et 81 micropuits.
   prudence: Évitez d’utiliser de l’agarose à bas point de fusion pour générer les moulages d’agarose pour le traitement de l’immunohistochimie (IHC).
2. Préparer les moulages d’agarose
   REMARQUE : Les moulages à 35 micropuits sont utilisés pour les tests d’invasion, d’immunofluorescence (IF) et d’isolement cellulaire. Les moulages à 81 micropuits sont utilisés pour les tests de cytotoxicité, d’IHC, d’isolement cellulaire et d’extraction d’acide ribonucléique (ARN).
   1. Une fois l’agarose autoclave, laissez l’agarose fondue refroidir à environ 60\u201270 °C. Dans une hotte de culture cellulaire, utiliser la technique aseptique et pipeter 500 μL d’agarose fondue dans un moule en caoutchouc de 81 micropuits par puits ou 330 μL dans un moule en caoutchouc de 35 micropuits par puits.
      prudence: Évitez de créer des bulles lors du mélange ou du pipetage de l’agarose. Éliminez les bulles en pipetant doucement.
   2. Une fois l’agarose solidifiée, fléchissez soigneusement le moule en caoutchouc pour en retirer le moulage d’agarose. Placez alors les mains au-dessus de la plaque de puits appropriée et laissez la coulée d’agarose tomber directement dans un puits de la plaque de puits.
      note: Fléchissez le moule en caoutchouc à différentes positions afin d’éviter une flexion excessive. Il peut être utile de fléchir le moule en caoutchouc et de pousser doucement par le bas en même temps.
   3. Pour équilibrer les moulages d'agarose, ajouter un milieu de culture cellulaire composé de milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (2,5 mL/puits pour une plaque à 12 puits et 1 mL/puits pour une plaque à 24 puits). Placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂) et incubez pendant 1 h.
3. Pendant ce temps, préparez la culture cellulaire pour l’ensemencement.
   note: Le nombre total de cellules ensemencées par moulage d’agarose doit être décidé par l’investigateur. Pour les lignées cellulaires murines de cancer du pancréas primitif, 35 000 cellules/35 micropuits coulés et 81 000 cellules/81 micropuits coulés (en moyenne 1000 cellules/sphéroïdes) sont ensemencés pour tous les tests suivants. Le diamètre moyen d’un sphéroïde est d’environ 150\u2012200 μm après 48 h.
4. Retirez d’abord le milieu de culture cellulaire entourant la coulée d’agarose à l’aide d’une pipette P1000 en inclinant la plaque du puits. Retirez ensuite délicatement le milieu dans la chambre de semis.
5. Semez soigneusement la suspension de cellules tumorales préparée goutte à goutte dans la chambre d’ensemencement cellulaire. Remettez délicatement la plaque à puits dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂) pendant 15 min
   note: Au cours de cette étape, les cellules vont s’installer dans les micropuits de l’agarose moulée.
6. Ajouter du milieu supplémentaire à l’extérieur de la coulée d’agarose (2,5 ml/puits pour une plaque à 12 puits et 1 ml/puits pour une plaque à 24 puits).
7. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂) pendant 48 h
   note: Habituellement, il faut jusqu’à quelques heures pour que les cellules forment des sphéroïdes dans les micropuits. En général, les sphéroïdes des cellules tumorales solides se forment après 24 h et sont stables après 48 h. Cependant, cela peut varier entre différentes lignées cellulaires. Si nécessaire, changez de milieu de culture cellulaire en inclinant soigneusement la plaque de puits avec les plâtres d’agarose et en retirant le milieu de culture cellulaire environnant à l’aide d’une pipette P1000. Ensuite, ajoutez délicatement du fluide frais en le pipetant le long de la paroi du puits. Habituellement, il n’est pas nécessaire de changer le support à l’intérieur des moulages en raison de son faible volume et du risque d’enlever les sphéroïdes.

2. Co-culture avec des lymphocytes T

1. Remettre en suspension le nombre requis de lymphocytes T dans 75 μL (coulée à 35 micropuits) ou dans 190 μL (coulée à 81 micropuits) du milieu de culture de cellules T approprié (IPRP complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 100 unités/mL de pénicilline/streptomycine).
2. Retirez d’abord le milieu de culture cellulaire entourant la coulée d’agarose à l’aide d’une pipette P1000 en inclinant la plaque du puits. Ensuite, retirez lentement et soigneusement le milieu à l’intérieur du plâtre en ciblant doucement un coin de la chambre d’ensemencement avec une pipette P200 tout en maintenant la plaque de puits inclinée de l’autre main.
3. (Étape critique 1) Comme il y a un risque d’enlever les sphéroïdes, contrôler la perte de sphéroïdes en comparant le nombre de sphéroïdes dans les micropuits avant et après l’enlèvement du milieu en observant au microscope à un grossissement de 10x.
4. Plantez soigneusement la suspension de cellules T goutte à goutte dans la chambre d’ensemencement de l’agarose coulée en tenant la pipette P200 à environ 0,5 cm au-dessus du plâtre.
5. (Étape critique 2) Il y a un risque d’éliminer les sphéroïdes lors de l’ajout des lymphocytes T. Par conséquent, il est essentiel d’ajouter les lymphocytes T très lentement et à environ 0,5 cm au-dessus de la chambre d’ensemencement.
   note: Une possibilité de réduire le nombre de sphéroïdes évacués est de pointer la pipette vers un coin de la chambre d’ensemencement tout en ajoutant les lymphocytes T, risquant ainsi de ne faire que rincer les sphéroïdes de ce coin.
6. Remettez délicatement la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂) pendant 15 min.
7. Sortez la plaque de puits de l’incubateur et ajoutez un milieu de culture cellulaire frais (milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 100 unités/ml de pénicilline/streptomycine) autour de l’agarose coulée en la pipetant lentement le long de la paroi du puits.
8. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 h.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de Pétri 3D	Microtissus Inc	Z764019 & Z764051	appelés « moules en caoutchouc » dans les protocoles ; moules à 81 micropuits et 35 moules à micropuits
Glissières de chambre à 8 puits	Lab-Tek	154534
Agarose de type I, faible EEO	Sigma-Aldrich	A6013
DMEM, sérum fœtal bovin	ThermoFisher	11965092, 16000044	Appelé « milieu de culture cellulaire » dans les protocoles
RPMI	ThermoFisher	11875093	pour milieu de culture de cellules T