Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Procédure d’acufection
REMARQUE : La quantité optimale d’ADN et la surface de la peau cible peuvent varier pour différents gènes et doivent être encore optimisées. La force de piqûre et le nombre de fois pour détacher la couche cornée de la peau peuvent également varier en fonction de l’épaisseur de la peau. Ces conditions doivent être soigneusement déterminées après évaluation du niveau d’expression des transcrits de gènes acufectés par qRT-PCR.
- Peser les souris et administrer du tribromoéthanol (400 μg par g de poids corporel) par injection péritonéale.
REMARQUE : Le 2,2,2-tribromoéthanol est un agent anesthésique injectable couramment utilisé chez les souris. Les solutions sont obtenues en dissolvant un 2,2,2-tribromoéthanol de qualité non pharmaceutique (2,5 g) dans de l’eau distillée (200 ml) contenant 2,5 % de 2-méthyl-2-butanol.
- Utilisez une pommade ophtalmologique vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
note: L’effet anesthésique sera induit en 1 à 2 min. Vérifiez le réflexe de pincement des orteils pour vous assurer que l’anesthésie est suffisamment profonde avant l’opération.
- Rasez la peau du flanc dorsal et appliquez une crème dépilatoire pour dissoudre les protéines de kératine dans la tige du cheveu.
note: L’utilisation d’une crème dépilatoire pour enlever les poils facilitera l’infusion d’ADN dans la peau.
- Utilisez des boules de coton imbibées d’eau pour essuyer la crème dépilatoire.
note: La crème dépilatoire est soluble dans l’eau. L’élimination complète de la crème évitera une surface grasse et assurera un meilleur résultat de piqûre.
- Utilisez un coton-tige stérile imbibé d’éthanol à 70 % pour désinfecter la surface de la peau.
- Marquez la zone cible (1 cm x 1 cm) sur la peau épilée à l’aide d’un pochoir pré-mesuré. note: Le marquage du site cible aidera à appliquer le faisceau d’aiguilles de haut en bas dans une zone définie. Ceci est important pour garantir l’administration de la même quantité d’ADN sur une surface spécifique afin de minimiser les variations d’une expérience à l’autre.
- Placez une goutte de 10 μL d’ADN plasmidique (10 μg) sur la peau marquée.
note: La quantité d’ADN pour l’acufection varie selon les gènes et le type de vecteur d’expression. La quantité d’ADN utilisée doit être soigneusement titrée avant de mener l’expérience d’intérêt. Le 10 μL est une petite goutte de liquide et il repose bien sur la peau rasée et épilée sans rouler pendant la piqûre. Incluez un groupe témoin de souris traitées avec 10 μL d’ADN vecteur vide à comparer avec des souris acufectées avec le gène à l’étude.
- Tenez le faisceau d’aiguilles d’acupuncture (Figure 1B) et piquez la surface marquée avec un mouvement de haut en bas 100 fois ou jusqu’à ce que l’humidité de l’ADN dans le PBS sur la peau disparaisse. note: Une certaine rougeur de la surface de la peau peut survenir. Évitez de faire des entailles profondes qui saignent.
Le nombre de mouvements de piqûre de haut en bas à la surface de la peau est déterminé de manière opérante lorsque l’humidité de l’ADN dans le PBS (10 μL) disparaît sur la peau. Nous avons décidé 100 fois en 30 secondes parce que cela a donné les résultats les plus cohérents à partir des gènes délivrés par l’acufection. Le cas échéant, les aiguilles peuvent être réutilisées pour un maximum de 6 piqûres cutanées cibles (1 cm x 1 cm chacune). Rincez les aiguilles avec de l’éthanol à 70 % et du PBS entre les acufections. Changez pour de nouvelles aiguilles lorsqu’elles sont émoussées ou pour de l’ADN plasmidique différent pour éviter la contamination croisée.
- Placez les souris acufectées sur un coussin chauffant pour maintenir la température du corps jusqu’à ce qu’elles soient réveillées.
- Renvoyez les souris dans leur cage lorsqu’elles ont repris suffisamment conscience. note: Gardez les souris acufectées dans une cage séparée (moins de 5 animaux par cage) de la cage des souris non acufectées.
- Mettez la bouteille d’eau en place et remettez la cage dans le support IVC (cage ventilée individuellement).
2. Soins postopératoires
- Pendant les 48 premières heures après l’intervention, surveillez de près les souris pour détecter tout inconfort, y compris des changements de comportement (agitation, agitation ou trouble de l’alimentation) ou une apparence anormale (pelage rugueux ou posture voûtée).
