Un test in vitro pour évaluer la cytotoxicité des cellules tueuses naturelles contre les cellules cancéreuses

Résumé

Source : Baik, C. H., et al. A Test-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la réalisation d’un test de libération de lactate déshydrogénase pour déterminer la cytotoxicité des cellules tueuses naturelles (NK) par rapport aux cellules cancéreuses cibles. Le test quantifie la libération de l’enzyme cytoplasmique lactate déshydrogénase par les cellules cancéreuses en mesurant l’absorbance du produit de couleur rouge formé.

Protocole

1. Dosage de cytotoxicité : Protocole de dosage

1. Utilisez une plaque à fond rond, traitée par culture à 96 puits pour installer la plaque comme suggéré dans le tableau 1. Ce tableau montre les contrôles expérimentaux et 3 ensembles de colonnes expérimentales NK. Cela peut être étendu à un total de 10 colonnes expérimentales NK dans une plaque de 96 puits.
2. Centrifuger la plaque de dosage à 250 x g pendant 4 min pour s’assurer que l’effecteur et les cellules cibles sont en contact. Incuber la plaque à 96 puits pendant 5 heures dans un incubateur à chambre humidifiée à 37 °C, 5 % de CO₂ pour obtenir un contact suffisant entre les cellules cibles et effectrices et la lyse des cellules cibles par les cellules effectrices.
   note: Le protocole peut être mis en pause ici.
3. 45 min avant de récolter les surnageants, ajoutez 10 μL de solution de lyse 10x dans les puits de libération maximale de LDH de la cellule cible (puits 1E, 1F, 1G et 1H) et remettez la plaque dans la chambre humidifiée.
4. Une fois le temps d’incubation terminé, centrifuger la plaque à 250 x g pendant 4 min. À l’aide d’un pipeteur multicanaux, transférer des aliquotes de 50 μL de tous les puits vers une nouvelle plaque d’essai à fond plat de 96 puits.
   note: Ne touchez pas le fond des puits afin que les cellules ne soient pas transférées dans la plaque de dosage fraîche. N’utilisez pas une plaque traitée de culture comme plaque de dosage fraîche.

2. Fabriquer le réactif de dosage.

1. Une fois que le tampon de dosage a atteint la température ambiante, ajoutez 12 ml de tampon de dosage dans une bouteille de mélange de substrat. Retournez et secouez doucement jusqu’à dissolution complète. 1 bouteille suffit pour deux plaques de 96 puits.
   note: Le tampon de dosage doit être protégé de la lumière pendant la décongélation. Mélanger immédiatement avant utilisation.
2. Ajouter 50 μL de réactif d’essai dans tous les puits de la plaque d’essai à partir de l’étape 4.6. Couvrez la plaque d’un film d’aluminium pour la protéger de la lumière et incubez pendant 30 min à température ambiante.
   note: Le réactif de dosage nouvellement fabriqué doit être conservé dans un congélateur. Le réactif est bon pendant environ 8 semaines.
3. Ajouter 50 μL de solution d’arrêt dans chaque puits. Lire la plaque dans l’heure qui suit l’ajout de la solution Stop et noter l’absorbance à 490 nm.
   Le tableau 2 présente des données représentatives.

Tableau 1 : Disposition de la plaque d’essai. TCS = Target cell Spontaneous LDH Release (50 μL cellules cibles + 50 μL de milieu cellulaire cible) ; TCM = Target Cell Maximum LDH Release (50 μL de cellules cibles + 50 μL de milieu cellulaire cible) ; VCC = Contrôle de la correction de volume (50 μL de milieu cellulaire cible + 50 μL de milieu cellulaire NK) ; CMB = contrôle de l’arrière-plan du milieu de culture (50 μL de milieu cellulaire cible + 50 μL de milieu cellulaire NK) ; ECSR = Cellule effectrice à libération spontanée (50 μL de cellules NK + 50 μL de cellules NK milieu) ; EW = Puits expérimentaux (cellules cibles de 50 μL + cellules NK de 50 μL).

1	deux	3	4	5
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcm	Répertoire CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	Répertoire CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	Répertoire CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	Répertoire CMB	EW-1	EW-2	EW-3

Tableau 2 : Données brutes d’absorbance d’une plaque de dosage contenant les contrôles expérimentaux dans les colonnes 1 et 2 et les puits expérimentaux pour mesurer la cytotoxicité des cellules NK placentaires de rats NP et RUPP par rapport aux cellules cibles YAC1.

1	deux	3	4	5
		Np	RUPP	Np
0,615	0,484	0,473	0,463	0,471
0,586	0,484	0,458	0,474	0,469
0,61	0,486	0,464	0,459	0,469
0,605	0,55	0,524	0,526	0,543
0,576	0,504	0,519	0,502 0,528	00.528
0,565	0,512	0,515	0,513	0,531
0,563	0,581	0,526	0,508	0,519

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture tissulaire à 96 puits	CELLTREAT	Référence 229190	Stérile, fond rond
Racleur de cellules	pêcheur	8100241
Cytotox 96 Kit de dosage de cytotoxicité non radioactive	Promega	G1780
RPMI	Gibco	11875135	1640 Moyen
Cellule YAC-1	ATCC	TIB-160