1. Synthèse du triacrylate de polycaprolactone (PCLTA)
- Sécher 3,2 mL de triol de polycaprolactone 400 Da (PCL) pendant une nuit à 50 °C dans une fiole ouverte de 200 mL à fond rond et du carbonate de potassium (K2CO3) dans un flacon en verre à 90 °C.
- Mélanger le triol avec 6,4 mL de dichlorométhane (DCM) et 4,246 g de K2CO3 sous argon.
- Mélanger 2,72 mL de chlorure d’acryloyle dans 27,2 mL de DCM et l’ajouter goutte à goutte au mélange réactionnel dans le ballon pendant 5 min.
- Couvrir le mélange réactionnel de papier d’aluminium et le laisser tranquille à température ambiante pendant 24 h sous argon.
- Après 24 h, filtrez le mélange réactionnel à l’aide d’un papier filtre sur un entonnoir Buchner sous vide pour éliminer l’excès de réactifs.
- Précipiter le filtrat de l’étape 1.5 qui contient le polymère embouté dans de l’éther diéthylique dans un rapport de 1:3 (vol/vol) et du rotavap à 30 °C pour éliminer l’éther diéthylique.
2. Formation de la polybulle
REMARQUE : L’injection de polymère dans l’eau désionisée (DI) provoquerait la migration des polybulles vers le fond du flacon, ce qui entraînerait un fond aplati. Utilisez plutôt de la carboxyméthylcellulose (CMC) à 10 % (poids/vol) pour remplir le flacon en verre afin d’éviter l’aplatissement des polybulles.
- Préparer une solution de CMC à 10 % (poids/vol) dans de l’eau DI.
- Remplissez un flacon en verre de 0,92 mL avec 0,8 mL de CMC à 10 % à l’aide d’une pipette de transfert de 1 mL.
- Mélanger 1000 mg/mL de PCL de 14 kDa dans du DCM et synthétiser le PCLTA dans un 1:3 (vol/vol) pour un volume total de 200 μL ou préparer 200 μL de 1000 mg/mL de poly (acide lactique-co-glycolique) diacrylate de 5 kDa (PLGADA) dans du chloroforme.
- Mélanger le mélange de 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyéthoxy)-2-méthylpropiophénone (photoinitiateur) avec le mélange de polymère (PLGADA ou PCL/PCLTA) en 0,005:1 (vol/vol).
- Chargez 200 μL de mélange de polymères dans une seringue en verre de 1 mL montée sur une pompe à seringue reliée à un tube de distribution en acier inoxydable d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.
- Utilisez un micromoteur pour contrôler le mouvement vers l’avant et vers l’arrière du tube de polymère afin d’injecter le polymère dans la CMC à 10 % du flacon en verre pour former la polybulle.
- Durcir les polybulles sous ultraviolet (UV) à une longueur d’onde de 254 nm pendant 60 s à 2 W/cm2.
- Congelez rapidement les polybulles dans de l’azote liquide et lyophilisez-les pendant une nuit sous vide de 0,010 mBar et à -85 °C.
- Séparez les polybulles de la CMC séchée à l’aide d’une pince et lavez les polybulles avec de l’eau DI pour éliminer tout résidu de CMC. Notez que d’autres polymères peuvent être utilisés, probablement avec des modifications pour modifier la cinétique de libération.
3. Modulation du diamètre de la polybulle
- Remplissez un flacon en verre de 0,92 mL avec 10 % de CMC à l’aide d’une pipette de transfert de 1 mL.
- Mélanger PCL/PCLTA dans un PCLTA 1:3 (vol/vol) avec 1000 mg/mL 14kDa PCLTA et synthétiser PCLTA. Mélangez le photoinitiateur avec un mélange de polymères dans un format 0,005:1 (vol/vol).
- Chargez le mélange de polymères dans une seringue en verre de 1 mL montée sur un pousse-seringue relié à un tube de distribution en acier inoxydable d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.
- Utilisez un micromoteur pour contrôler le mouvement vers l’avant et vers l’arrière du tube de polymère afin d’injecter le polymère dans la CMC à 10 % du flacon en verre pour former la polybulle.
- Pour obtenir des polybulles de différents diamètres, variez le taux de distribution de 0,0005 à 1 μL/s.
- Prenez des images du flacon avec les polybulles de diamètre variable.
- Utilisez ImageJ pour quantifier le diamètre des polybulles et utilisez la taille de la fiole comme échelle.
4. Centrage de la cargaison dans la polybulle
- Modulation de la viscosité PCL/PCLTA à l’aide de K2CO3 :
note: Il n’est pas nécessaire de modifier la viscosité du PLGADA à l’aide de K2CO3 car la viscosité du PLAGDA de 5 kDa à 1000 mg/mL est suffisante pour centrer la cargaison.
- Ajouter du K2CO3 (qui a été isolé après la réaction de l’ECLPC) à l’ARPC à diverses concentrations, notamment 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL et 60 mg/mL.
- Mesurez les viscosités dynamiques des solutions en modifiant le taux de cisaillement de 0 à 1000 1/s à l’aide de la rhéométrie.
- Injecter manuellement la cargaison au milieu (voir l’étape 4.2 pour préparer le mélange de cargaison) des polybulles qui se sont formées à l’aide des solutions PCL/PCLTA avec différentes concentrations de K2CO3 (étape 4.1.1). Déterminer la concentration optimale de K2CO3 en observant quelle solution de l’étape 4.1.1 peut entraîner la rétention de la cargaison au milieu.
- Centrage de la cargaison (faisabilité déjà démontrée avec de petites molécules) avec CMC
- Mélangez la cargaison avec 5 % (poids/vol) CMC dans un rotateur pendant la nuit pour augmenter la viscosité de la cargaison.
- Injectez manuellement 2 μL de mélange de cargaison dans la polybulle et procédez au durcissement UV à une longueur d’onde de 254 nm pendant 60 s à 2 W/cm2.
- Congeler rapidement les polybulles dans de l’azote liquide pendant 30 s et lyophiliser pendant la nuit à 0,010 mBar sous vide et à -85 °C.
- Séparez les polybulles de la CMC séchée à l’aide d’une pince et lavez-les à l’eau DI pour éliminer toute CMC résiduelle.
- Coupez la polybulle en deux et imagez les moitiés à l’aide de la microscopie confocale pour vous assurer que la cargaison est centrée (reportez-vous à l’étape 6 pour les longueurs d’onde d’excitation et d’émission utilisées).
5. Formulation de la cargaison
REMARQUE : La formulation Polybubble peut contenir différents types de marchandises, y compris de petites molécules, des protéines et des acides nucléiques.
- Sur la base d’études antérieures, dans le cas du fret de protéines, utilisez des excipients tels que le polyéthylène glycol (PEG), la polyvinylpyrrolidone (PVP) et les glycopolymères pour améliorer la stabilité des protéines lors de la formulation de polybulles.
- Formez des polybulles basées sur le protocole de l’étape 2.
- Préparez la solution d’antigène en ajoutant 17,11 g de tréhalose à 625 μL d’antigène gp120/41 du VIH.
- Injecter manuellement 1 μL de solution d’antigène au milieu de la polybulle.
- Ouvrez les polybulles aux jours 0, 7, 14 et 21 et enregistrez la fluorescence de l’antigène avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 497 nm et 520 nm, respectivement.
- Déterminez la fonctionnalité de l’antigène à l’aide d’un test immuno-enzymatique (ELISA) et utilisez du lait écrémé à 5 % comme tampon bloquant.
6. Mainlevée de la cargaison
REMARQUE : Une petite molécule ou un antigène peut être utilisé comme type de cargaison
- Petite molécule
- Incuber des polybulles avec de l’acriflavine centrée dans 400 μL de solution saline tampon phosphate (PBS) à 37 °C, 50 °C pour les polybulles PLGADA et à 37 °C, 50 °C, 70 °C pour les polybulles PCL/PCLTA.
note: La raison pour laquelle nous recommandons de tester au-dessus des températures corporelles est de a) simuler la température (50 °C) à laquelle la polybulle atteint lors de l’analyse laser des nanotiges d’or (AuNR) dans PCL et PLGA ; et b) accélérer le processus de dégradation du PCL (50 °C, 70 °C).
- À chaque point temporel, recueillir les surnageants et les remplacer par 400 μL de PBS frais.
- À l’aide d’un lecteur de plaques, quantifier les intensités de fluorescence dans les surnageants collectés.
note: Utiliser ex/em de 416 nm/514 nm pour l’acriflavine.
- antigène
- Incuber des polybulles avec du sérum d’albumine bovine centré (BSA)-488 dans 400 μL de PBS à 37 °C, 50 °C pour les polybulles PLGADA et à 37 °C, 50 °C pour les polybulles PCL/PCLTA.
- À chaque point temporel, recueillir les surnageants et les remplacer par 400 μL de PBS frais.
- À l’aide d’un lecteur de plaques, quantifiez les intensités de fluorescence dans les surnageants collectés. Utilisez ex/em de 497 nm/520 nm pour BSA-488.
note: Il ne faut pas effectuer d’étude de libération à 70 °C pour les polybulles PCL/PCLTA afin d’éviter d’exposer l’antigène à des températures extrêmes.