Un test pour évaluer les effets anticancéreux du surnageant acellulaire de Lactobacillus

Résumé

Source : Lee, J., et al. Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant acellulaire de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente un test in vitro pour étudier les effets anticancéreux du surnageant acellulaire de Lactobacillus (LCFS). Lors de l’exposition de sphéroïdes du cancer colorectal à des doses variables de LCFS, l’interaction avec les métabolites bactériens dans le LCFS induit l’apoptose dans les cellules cancéreuses, perturbant la structure sphéroïde et conduisant à la mort cellulaire de manière dose-dépendante.

Protocole

1. Cultures cellulaires bactériennes et préparation du surnageant acellulaire de Lactobacillus (LCFS)

REMARQUE : Les étapes 1.2 à 1.9 sont effectuées dans une chambre anaérobie.

1. Préparez une plaque de gélose De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) et un bouillon contenant de la L-cystéine et stérilisez à l’autoclavage.
2. Pré-incuber la plaque de gélose MRS dans une chambre anaérobie H₂ maintenue à 37 °C avec 20 ppm d’oxygène.
3. Décongeler le stock bactérien de Lactobacillus et inoculer la plaque de gélose avec la culture bactérienne (figure 1A (i)).
4. Incuber les bactéries pendant 2 à 3 jours dans une chambre anaérobie H₂ à 37 °C et 20 ppm d’oxygène jusqu’à l’obtention de colonies bactériennes uniques.
5. Laver et sécher le tube de culture anaérobie de type Hungate. Autoclave le tube de culture à 121 °C pendant 15 min.
6. Ensuite, incubez le tube dans une chambre anaérobie H₂ à 37 °C et 20 ppm d’oxygène pour éliminer l’oxygène.
7. Placer 2 à 3 ml de bouillon MRS dans le tube. Fermez le tube avec un bouchon en caoutchouc butyle et vissez le bouchon.
8. Obtenez une seule colonie à l’aide d’une boucle et placez-la dans le tube de culture de 1,5 mL avec 500 μL de 1x PBS. (Figure 1A (ii)).
9. Suspendre la colonie à l’aide d’une seringue de 1 mL (figure 1A (iii)). Pour ce faire, insérez l’aiguille de la seringue de 1 mL au centre du couvercle du tube, aspirez la colonie en suspension, puis remettez-la en suspension dans le milieu de bouillon MRS. (Figure 1A (iv)).
10. Incuber le milieu de bouillon MRS dans un incubateur agitateur pendant 2 jours (37 °C, 5 % CO₂, 200 tr/min).
11. Mesurez la densité optique (DO) à l’aide d’un spectrophotomètre pour surveiller les courbes de croissance bactérienne jusqu’à ce que l’absorbance à₆₂₀ OD atteigne 2,0.
12. Séparer les granules bactériennes et le milieu conditionné par centrifugation à 1 000 x g pendant 15 min. Laver les granulés bactériens collectés avec 1x PBS et remettre en suspension dans 4 ml de RPMI 1640 complété par 10 % de sérum de veau fœtal. N’incluez pas d’antibiotiques dans le milieu.
13. Maintenir les granulés bactériens dans RPMI et incuber dans un incubateur agitateur pendant 4 h à 37 °C avec 5 % de CO₂ à une vitesse de 100 tr/min.
14. Pour la préparation du surnageant probiotique, prélever la pastille bactérienne par centrifugation à 1000 x g, pendant 15 min à 4 °C. Filtrer stérilement le surnageant récupéré à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et le conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.

2. Génération de sphéroïdes

1. Préparation des lignées cellulaires du cancer colorectal
   1. Cultiver des lignées cellulaires DLD-1, HT-29 et WiDr en monocouches jusqu’à une confluence de 70 à 80 % et incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ (milieu de croissance : RPMI contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine).
   2. Pour les cellules cultivées dans une boîte de Pétri de 100 mm, laver la plaque deux fois avec 4 mL de 1x PBS. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber la boîte de Pétri pendant 2 min à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pour dissocier les cellules.
   3. Après l’incubation, vérifier la dissociation cellulaire au microscope et neutraliser la trypsine-EDTA avec 5 ml de milieu de croissance.
   4. Transférez les cellules dissociées dans un tube conique de 15 mL et centrifugez pendant 3 min à 300 x g.
   5. Jeter le surnageant et le remettre en suspension doucement avec 3 mL de milieu de croissance.
   6. Comptez les cellules avec du bleu trypan pour déterminer les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre. (Figure 1B (i))
2. Formation de sphéroïdes
   1. Dans un tube conique de 15 mL, diluer les cellules de 2.1.5 pour obtenir 1 - 2 x 10⁵ cellules/mL (Figure 1B (ii))
   2. Ajouter la concentration finale de 0,6 % de méthylcellulose à la suspension cellulaire et transférer les cellules diluées dans un réservoir stérile.
      REMARQUE : Pour chaque lignée cellulaire, la quantité de méthylcellulose nécessaire doit être titrée et déterminée en conséquence.
   3. À l’aide d’une pipette multicanaux, versez 200 μL de cellules dans chaque puits d’une microplaque à fond rond de 96 puits à fixation ultra-basse. (Figure 1B (iii))
   4. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 24 à 36 h.
   5. Après 24 à 36 h, observez la plaque au microscope optique pour vous assurer de la formation des sphéroïdes.

3. Traitement des cellules cancéreuses colorectales 3D avec LCFS

1. Générez des sphéroïdes comme décrit aux étapes 2 et 3.
2. Avant d’effectuer le traitement LCFS, décongelez le LCFS congelé à température ambiante (RT) pendant 10 à 20 min.
3. Inoculez la solution mère LCFS dans un milieu de croissance. Diluer en série à 25 %, 12,5 % et 6 % dans le milieu de croissance (c.-à-d. 25 % LCFS = 150 μL de milieu de croissance + 50 μL de LCFS).
4. Sortez la plaque de culture cellulaire contenant les sphéroïdes de l’incubateur et retirez la plus grande partie possible du milieu de croissance de chaque puits à l’aide d’une pipette de 200 μL.
5. Ajouter le milieu de culture avec LCFS sur les cellules et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 24 à 48 h.
   note: Le volume à utiliser dépendra de la taille de la plaque comme suit : 2 mL pour les plaques de culture cellulaire à 6 puits ; 200 μL pour les plaques de culture cellulaire à 96 puits.

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique de la formation des sphéroïdes et de la préparation du LCFS.

(A) Les images de représentation schématique du protocole de génération LCFS sont marquées par (i-iv) (B) Les schémas de la formation des sphéroïdes médiés par la méthylcellulose sont marqués par (i-iii).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Film adhésif optique MicroAmp d’Applied Biosystems	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 couverts
Axygen 2,0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifugeuse Tube, Polypropylène, Transparent, Non stérile, 500 tubes/paquet, 10 paquets/caisse	Corning	SCT-200-C	500 tubes/paquet, 10 paquets/caisse
BD Difco Bacto Agar	Bd	Référence 214010	500 grammes
BD Difco Lactobacilli MRS Bouillon	Bd	Référence : DF0881-17-5	500 grammes
Solution saline tamponnée au phosphate Corning, 1X sans calcium ni magnésium, PH 7,4 ± 0,1	Corning	Référence 21-040-CV	500 ml
Falcon Tube à essai en polystyrène à fond rond de 5 ml, avec capuchon à pression pour crépine de cellule	Corning	352235	25/paquet, 500/caisse
Sérum fœtal de bovin, certifié, origine US	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 ml
Lactobacillus fermentum	Collection coréenne pour les cultures de types	KCTC 3112
Chlorhydrate de L-cystéine monohydraté	Sigma-Aldrich	Réf. C6852-25G	25 grammes
Méthylcellulose (3500-5600mPa·s, 2 % dans l’eau à 20°C)	TCI	Référence M0185	500 grammes
Plaque de réaction optique rapide à 96 puits MicroAmp avec code-barres, 0,1 mL	Biosystèmes appliqués	4346906	20 assiettes
Millex-GS Unité de filtration à seringue, 0,22 μm, esters de cellulose mixtes, 33 mm, stérilisé à l’oxyde d’éthylène	Millipore	SLGS033SB	250
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml
Réf. RPMI-1640	Gibco	11875 à 119	500 ml
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 ml
Matériaux/équipements/logiciels
Incubateur de CO2	Thermo-pêcheur	HERAcell 150i
Tube conique 15 ml	Spl	Référence 50015
Tube conique 50 ml	Spl	Référence 50050
Corning Costar Plaque à puits multiples à fixation ultra-faible	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar Plaque à puits multiples à fixation ultra-faible	Sigma-Aldrich	CLS3471
Réservoirs de réactifs Costar de 50 ml, 5/sac, stériles	Costar	N° 4870
Lames de chambre de comptage de cellules Countess	Thermopêcheur	Réf. C10228
Compteur de cellules automatisé Countess II FL	Invitrogen	AMQAF1000
Lecteur multimode EnSpire	Perkin Elmer		Enspire 2300
Pipette multicanaux Eppendorf Research Plus, 8 canaux	Eppendorf	3122000051
Agitateur incubé	Compagnon de laboratoire	SIF-6000R
Multi-jauge Ver. 3.0,	Fujifilm		Tokyo, Japon
Spectrophotomètres UV/Vis lambda	Perkin Elmer		Waltham, MA, États-Unis
Microscope à contraste de phase	Olympe		Tokyo, Japon
Tube de microcentrifugation SPL 1,5 ml	Spl	Référence 60015
Réservoirs multicanaux SPL, 12 canaux, PS, stérile	Spl	Référence 21012
Processeurs de liquides à ultrasons Vibra-Cell	Cellule vibra SONICS	VC 505	Processeur à ultrasons de 500 watts
Chambre anaérobie en vinyle	PRODUITS COY LAB