Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Traitement du sang de cordon ombilical et isolement des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines (HSPC)
- Effectuer toutes les étapes du protocole dans des conditions stériles dans des armoires à flux laminaire.
- Prélever du sang de cordon ombilical (CB) dans des tubes héparinés et augmenter le volume jusqu’à 35 mL en ajoutant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Superposez l’échantillon sur le milieu de séparation des lymphocytes (LSM) comme illustré à la figure 1 et centrifugez le LSM avec le CB stratifié à 400 x g pendant 35 min à 4 °C sans freins.
note: Diluez le sang avec précaution et douceur pour éviter de le mélanger à l’interface.
- Retirez soigneusement la couche supérieure de LSM et de plasma et transférez l’interface de la couche leucocytaire blanche dans un nouveau tube à l’aide d’une pipette de transfert.
- Remettre la couche leucocytaire en suspension dans 30 à 40 mL de tampon glacé (PBS + 0,5 % d’albumine sérique bovine [BSA] + 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA]). À l’aide d’une pipette, mélanger 20 μL de suspension cellulaire avec 20 μL de bleu de trypan à 0,4 % et pipeter 10 μL du mélange dans l’ouverture extérieure de l’une des deux chambres d’une lame de comptage et insérer la lame dans un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules.
note: Utilisez un tampon glacé à toutes les étapes, car il aide à maintenir les cellules viables.
- Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 4 °C et aspirer le surnageant avec précaution. Ajoutez ensuite 300 μL de tampon glacé.
- Ajouter 100 μL de réactif bloquant le récepteur Fc humain et 100 μL de microbilles conjuguées d’anticorps CD34 humains de souris monoclonales pour un maximum de 1 x 108 cellules (voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à 4 °C, ajouter 10 mL de tampon glacé pour laver les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C
REMARQUE : Augmentez la taille en fonction du numéro de cellule si plus de 1 x 108 cellules sont présentes.
- Retirez délicatement le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 500 μL de tampon et procédez à l’étape de séparation magnétique pour enrichir les HSPC.
- Placez une colonne LS de sélection positive (voir la Table des matériaux) dans le champ de tri des cellules activé magnétiquement et passez-la avec 3 mL de tampon.
- Chargez l’échantillon dans la colonne LS qui peut piéger les microbilles liées au CD34+ humain dans les échantillons et laissez-le s’écouler sous l’influence de la gravité dans le tube de prélèvement.
- Lavez la colonne 3x avec un tampon et récupérez l’élué dans le même tube de collecte de la fraction CD34- des cellules.
- Plonger la colonne avec 5 mL de tampon pour éluer les cellules CD34+ dans un nouveau tube de collecte. Répétez la procédure pour obtenir une pureté de >90 %.
- Comptez les cellules CD34+ éluées à l’aide d’un colorant bleu trypan dans un hémocytomètre. Après le comptage, centrifugez les cellules CD34+ à 300 x g pendant 5 min et jetez le surnageant.
- Remettre les cellules CD34+ en suspension dans 25 μL de PBS pour une injection à utiliser immédiatement lors de la transplantation ou cryoconserver les cellules à une concentration de 1 à 2 millions/mL dans un milieu de congélation (milieu du Roswell Park Memorial Institute [milieu RPMI 1640] + 50 % de sérum de bovin fœtal (FBS) + 10 % de diméthylsulfoxyde [DMSO]) pour une utilisation ultérieure en transplantation.
note: Comptez toujours les cellules viables avant de les utiliser en transplantation.
- Pour vérifier la pureté de l’élu CD34+, prélever 50 μL de suspension et l’incuber avec 10 μL de phycoérythrine ou d’anticorps anti-CD34 humain conjugué au PE pendant 30 min à 4 °C. Après l’incubation de l’anticorps, lavez les cellules colorées avec du PBS, mettez-les en suspension dans 100 μL de PBS, puis procédez à la cytométrie en flux. Ajoutez un tube supplémentaire de cellules sans anticorps pour concevoir la porte dans le cytomètre en flux.
- Après l’acquisition, analysez les données en sélectionnant la région d’intérêt sur un graphique de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC), suivi d’une porte pour les cellules uniques sur les graphiques de surface FSC et de hauteur FSC. Cellules CD34-positives sur des cellules uniques dans le graphique du canal PE et de la zone SSC.
2. Préparation des hépatocytes humains (HEP) pour la transplantation
- Retirez les hépatocytes cryoconservés de l’azote liquide, immergez rapidement le flacon dans le bain-marie et décongelez-le pendant environ 90 à 120 s.
- Retirer le capuchon du flacon et verser les hépatocytes décongelés dans le tube conique de 50 mL du milieu de décongélation réchauffé.
- Mettez les cellules en suspension en balançant le tube de 50 ml à la main pendant quelques secondes.
note: Ne vortex pas le tube.
- Granulez les cellules à 100 x g pendant 8 min à température ambiante. Lavez les cellules granulées dans du PBS avec 0,1 % de BSA et regroupez-les avec des HSPC frais ou décongelés (rapport 10:1) dans du PBS dans un volume final de 80 μL/souris.
3. Manipulation des animaux, dépistage, génotypage et traitement des HSPC humains et de la transplantation d’hépatocytes
- Manipulation d’animaux
- À la suite d’une immunodéficience sévère, élevez, hébergez et manipulez des souris TK-NOG dans des conditions aseptiques.
- Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants, des couvre-chaussures et un masque facial pour éviter l’infection par des micro-organismes potentiellement pathogènes.
- Utilisez des gants et des instruments stériles pour la chirurgie et manipulez les animaux de manière aseptique tout au long de la chirurgie.
- Sélection de souris TK-NOG pour l’expérience
- Maintenir la colonie de souche TK-NOG en accroisant des souris TK-NOG femelles avec des compagnons de portée mâles non TK-NOG et sélectionner la progéniture transgénique par génotypage.
note: Effectuer le génotypage (voir étape 3.3) pour déterminer la présence ou l’absence du transgène chez les souris mâles et femelles nouveau-nées au moment du sevrage.
- Sélectionner des mâles âgés de 6 à 8 semaines pour la transplantation en raison de leur grande sensibilité à la déplétion médiée par le GCV des hépatocytes exprimant le transgène HSV-TK.
- Étiquetez les souris au moment du sevrage ou de la chirurgie pour faciliter l’identification. Notez le poids et l’état de santé des animaux.
- Génotypage de la présence du transgène HSV-TK à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel
- Effectuer le génotypage au moment du sevrage (généralement à l’âge de 3 à 4 semaines). Pour le génotypage, coupez un morceau de l’oreille de souris dans une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire pour maintenir la stérilité et extrayez l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’isolement d’ADN génomique.
- Amplifier l'ADN génomique extrait de l'oreillette dans un mélange réactionnel de 20 μL pour dépister le transgène HSV-TK sous le contrôle du promoteur d'albumine humaine en ajoutant 1 μL d'amorce directe 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL d'amorce inverse 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL de sonde FAM 5′-FAM-AATCGCCCGCGCGCGCCTGC-MGB-3', et 10 μL de mélange maître sur un instrument de réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel.
- Réglez les paramètres de PCR en temps réel comme suit : 60 °C pendant 30 s (étape de prélecture), 95 °C pendant 10 min (étape de maintien), 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min (étape de PCR) et 60 °C pendant 30 s (étape de post-lecture).
note: Un cycle de seuil (Ct) inférieur à 22 est considéré comme positif pour le transgène HSV-TK.
- Traitement à base de ganciclovir et de tréosulfan
- À l'aide d'une aiguille de 27 G, injecter aux souris TK-NOG des injections intrapéritonéales de GCV (6 mg/kg) 2 fois par jour au jour 7 et au jour 5 dans 100 μL de solution saline avant la chirurgie pour épuiser les cellules parenchymateuses transgéniques des souris (comme le montre la stratégie expérimentale de la figure 2).
- Les jours 3, 2 et 1 avant la chirurgie, préconditionner les souris avec des doses intrapéritonéales non myéloablatives de tréosulfan (1,5 g/kg/jour) dans 100 μL de solution saline, à l’aide d’une aiguille de 27 G.
- La veille de l’opération, prélevez deux à trois gouttes (~100 μL) de sang dans la veine sous-mandibulaire en la piquant avec une lancette de 5 mm, et isolez le sérum par centrifugation (1 500 x g pendant 10 min à 4 °C) pour le dosage de l’alanine aminotransférase (ALT) afin d’évaluer le degré de lésion hépatique.
- Préparation à l’opération
- Utilisez une tondeuse pour raser la fourrure de la souris entourant le site de l'incision (à gauche de la paroi péritonéale) avant la chirurgie.
- Ajustez le débit d’oxygène à 1 L/min et le débit d’isoflurane à 3 % à 5 % dans une chambre d’induction à l’aide d’un appareil d’anesthésie de souris. Placez une souris à la fois dans la chambre d’induction pour l’anesthésie.
- Fixez l’extrémité d’un tube d’extension stérile (d’une capacité de suspension de 550 μL ; voir le tableau des matériaux pour les spécifications) à une aiguille de 30 g et l’autre extrémité à une seringue de 1 mL.
- Remplissez la seringue avec la suspension (80 μL/souris) de HEP et HSPC groupés (voir rubrique 2), insérez la seringue dans l’encoche d’une pipette de distribution répétitive et ajustez le distributeur pour distribuer 10 μL dans chaque pression.
- Une fois les souris anesthésiées (généralement après 3 à 4 minutes), basculez le débit d’isoflurane vers le cône nasal et réduisez le débit d’isoflurane à 2 % - 3 %.
- Transplantation intrasplénique de HSPC et d’hépatocytes humains chez la souris
- Effectuez toutes les étapes chirurgicales dans une armoire à flux laminaire dans des conditions stériles.
- Placez un champ propre et stérile sur la surface de travail et frottez le côté gauche du corps de chaque souris avec 10 % de povidone iodé suivi d’alcool isopropylique à 70 %, avant de faire une incision.
- Faites une petite incision (~1 à 1,5 cm de longueur et 5 mm de profondeur) dans la peau, le muscle et le péritoine à gauche de la paroi péritonéale avec des ciseaux de type Vanna pour pénétrer dans la cavité péritonéale à environ 5 mm sous le bord inférieur de la cage thoracique.
- Localisez la rate, tirez-la légèrement avec une pince vers la zone de fonctionnement pour un accès facile, et insérez l’aiguille 30 G dans le pôle inférieur de la rate.
- Déverrouillez le piston de la pipette distributrice et distribuez 10 μL du volume à la fois, avec une limite de 60 à 80 μL par rate. Rétractez lentement l’aiguille et coupez la rate avec des clips de ligature à l’aide d’un applicateur de ligature.
- Repoussez la rate dans la cavité corporelle à l’aide d’applicateurs à embout de coton imbibés de PBS stérile.
- Fermez la couche musculaire de la paroi abdominale à l’aide d’un modèle de suture interrompue (non continu) résorbable. Réalisez la fermeture de la peau avec un motif de suture interrompu à l’aide de sutures non résorbables.
